Metabolit imunomodulator merupakan ciri utama persekitaran mikro tumor (TME), tetapi dengan beberapa pengecualian, identiti mereka masih tidak diketahui. Di sini, kami menganalisis tumor dan sel T daripada tumor dan asites pesakit dengan karsinoma serous gred tinggi (HGSC) untuk mendedahkan metabolit bagi petak TME yang berbeza ini. Asites dan sel tumor mempunyai perbezaan metabolit yang ketara. Berbanding dengan asites, sel T yang menyusup ke tumor diperkayakan dengan ketara dalam 1-metilnikotinamida (MNA). Walaupun tahap MNA dalam sel T meningkat, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim yang memangkinkan pemindahan kumpulan metil daripada S-adenosilmetionina kepada nikotinamida) adalah terhad kepada fibroblas dan sel tumor. Secara fungsinya, MNA mendorong sel T untuk merembeskan faktor nekrosis tumor alfa sitokin yang menggalakkan tumor. Oleh itu, MNA yang berasal dari TME menyumbang kepada pengawalaturan imun sel T dan mewakili sasaran imunoterapi yang berpotensi untuk rawatan kanser manusia.
Metabolit yang berasal dari tumor boleh mempunyai kesan perencatan yang mendalam terhadap imuniti anti-tumor, dan semakin banyak bukti menunjukkan bahawa ia juga boleh berfungsi sebagai penggerak utama untuk perkembangan penyakit (1). Selain kesan Warburg, kajian terbaru telah mula mencirikan keadaan metabolik sel tumor dan hubungannya dengan keadaan imun persekitaran mikro tumor (TME). Kajian terhadap model tikus dan sel T manusia telah menunjukkan bahawa metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) dan metabolisme glukosa (4) boleh bertindak secara bebas pada pelbagai subkumpulan sel imun. Beberapa metabolit dalam laluan ini menghalang fungsi anti-tumor sel T. Telah terbukti bahawa sekatan koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) boleh merosakkan percambahan sel T, dan peningkatan BH4 dalam badan boleh meningkatkan tindak balas imun anti-tumor yang dimediasi oleh CD4 dan CD8. Di samping itu, kesan imunosupresif kynurenine boleh diselamatkan dengan pemberian BH4 (5). Dalam glioblastoma mutan isositrat dehidrogenase (IDH), rembesan enantiometabolik (R)-2-hidroksiklutarat (R-2-HG) menghalang pengaktifan, percambahan dan Aktiviti sitolisis sel T (6). Baru-baru ini, telah ditunjukkan bahawa metilglioksal, hasil sampingan glikolisis, dihasilkan oleh sel penindas yang berasal dari myeloid, dan pemindahan sel T metilglioksal boleh menghalang fungsi sel efektor T. Dalam rawatan, peneutralan metilglioksal boleh mengatasi aktiviti sel penindas yang berasal dari myeloid (MDSC) dan meningkatkan terapi sekatan titik pemeriksaan secara sinergistik dalam model tikus (7). Kajian-kajian ini secara kolektif menekankan peranan utama metabolit yang berasal dari TME dalam mengawal selia fungsi dan aktiviti sel T.
Disfungsi sel T telah dilaporkan secara meluas dalam kanser ovari (8). Ini sebahagiannya disebabkan oleh ciri-ciri metabolik yang wujud dalam hipoksia dan vaskular tumor yang tidak normal (9), yang mengakibatkan penukaran glukosa dan triptofan kepada produk sampingan seperti asid laktik dan kynurenine. Laktat ekstraselular yang berlebihan mengurangkan penghasilan interferon-γ (IFN-γ) dan memacu pembezaan subkumpulan mielosupresif (10, 11). Penggunaan triptofan secara langsung menghalang percambahan sel T dan menghalang isyarat reseptor sel T (12-14). Walaupun pemerhatian ini, banyak kerja berkaitan metabolisme imun telah dijalankan dalam kultur sel T in vitro menggunakan media yang dioptimumkan, atau terhad kepada model tikus homolog in vivo, yang kedua-duanya tidak mencerminkan sepenuhnya heterogeniti kanser manusia dan persekitaran makro dan mikro fisiologi.
Ciri umum kanser ovari ialah penyebaran peritoneal dan kemunculan asites. Pengumpulan cecair sel dalam asites dikaitkan dengan penyakit lanjut dan prognosis yang buruk (15). Menurut laporan, petak unik ini hipoksik, mempunyai tahap faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) dan indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) yang tinggi, dan disusupi oleh sel pengawalseliaan T dan sel perencat myeloid (15-18). Persekitaran metabolik asites mungkin berbeza daripada tumor itu sendiri, jadi pengaturcaraan semula sel T dalam ruang peritoneal tidak jelas. Di samping itu, perbezaan utama dan heterogeniti antara asites dan metabolit yang terdapat dalam persekitaran tumor boleh menghalang penyusupan sel imun dan fungsinya pada tumor, dan penyelidikan lanjut diperlukan.
Untuk menyelesaikan masalah ini, kami mereka bentuk kaedah pemisahan sel sensitif dan kromatografi cecair spektrometri jisim tandem (LC-MS/MS) untuk mengkaji pelbagai jenis sel (termasuk sel CD4+ dan CD8+ T) serta di dalam dan di antara tumor. Metabolitnya merangkumi sel dalam asites dan persekitaran tumor yang sama dengan pesakit. Kami menggunakan kaedah ini bersama-sama dengan sitometri aliran dimensi tinggi dan penjujukan RNA sel tunggal (scRNA-seq) untuk memberikan gambaran status metabolik populasi utama ini yang sangat jelas. Kaedah ini mendedahkan peningkatan ketara dalam tahap 1-metilnikotinamida (MNA) dalam sel T tumor, dan eksperimen in vitro menunjukkan bahawa kesan imunomodulatori MNA pada fungsi sel T sebelum ini tidak diketahui. Secara amnya, kaedah ini mendedahkan interaksi metabolik bersama antara tumor dan sel imun, dan memberikan pandangan unik tentang metabolit pengawalaturan imun, yang mungkin berguna untuk rawatan peluang rawatan imunoterapi kanser ovari berasaskan sel T.
Kami menggunakan sitometri aliran dimensi tinggi untuk mengukur pengambilan glukosa secara serentak [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukosa (2-NBDG) dan aktiviti mitokondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) adalah penanda tipikal bersebelahan yang membezakan sel imun dan populasi sel tumor (Jadual S2 dan Rajah S1A). Analisis ini menunjukkan bahawa berbanding dengan sel T, asites dan sel tumor mempunyai tahap pengambilan glukosa yang lebih tinggi, tetapi mempunyai perbezaan yang lebih kecil dalam aktiviti mitokondria. Pengambilan glukosa purata sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] adalah tiga hingga empat kali ganda daripada sel T, dan pengambilan glukosa purata sel T CD4 + adalah 1.2 kali ganda daripada sel T CD8 +, yang menunjukkan limfosit penyusupan tumor (TIL) mempunyai keperluan metabolik yang berbeza walaupun dalam TME yang sama (Rajah 1A). Sebaliknya, aktiviti mitokondria dalam sel tumor adalah serupa dengan sel CD4 + T, dan aktiviti mitokondria kedua-dua jenis sel adalah lebih tinggi daripada sel CD8 + T (Rajah 1B). Secara amnya, keputusan ini mendedahkan tahap metabolik. Aktiviti metabolik sel tumor adalah lebih tinggi daripada sel CD4 + T, dan aktiviti metabolik sel CD4 + T adalah lebih tinggi daripada sel CD8 + T. Walaupun terdapat kesan ini merentasi jenis sel, tiada perbezaan yang konsisten dalam status metabolik sel CD4 + dan CD8 + T atau perkadaran relatifnya dalam asites berbanding dengan tumor (Rajah 1C). Sebaliknya, dalam pecahan sel CD45, perkadaran sel EpCAM+ dalam tumor meningkat berbanding dengan asites (Rajah 1D). Kami juga memerhatikan perbezaan metabolik yang jelas antara komponen sel EpCAM+ dan EpCAM-. Sel EpCAM+ (tumor) mempunyai pengambilan glukosa dan aktiviti mitokondria yang lebih tinggi daripada sel EpCAM-, yang jauh lebih tinggi daripada aktiviti metabolik fibroblas dalam sel tumor dalam TME (Rajah 1, E dan F).
(A dan B) Keamatan pendarfluor median (MFI) pengambilan glukosa (2-NBDG) (A) dan aktiviti mitokondria sel CD4 + T (MitoTracker merah gelap) (B) Graf perwakilan (kiri) dan data berjadual (Kanan), sel CD8 + T dan sel tumor EpCAM + CD45 daripada asites dan tumor. (C) Nisbah sel CD4 + dan CD8 + (sel CD3 + T) dalam asites dan tumor. (D) Perkadaran sel tumor EpCAM + dalam asites dan tumor (CD45−). (E dan F) Pengambilan glukosa EpCAM + CD45-tumor dan matriks EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) dan aktiviti mitokondria (MitoTracker merah gelap) (F) graf perwakilan (kiri) dan data berjadual (Kanan) Asites dan sel tumor. (G) Graf perwakilan ekspresi CD25, CD137 dan PD1 melalui sitometri aliran. (H dan I) Ekspresi CD25, CD137 dan PD1 pada sel CD4 + T (H) dan sel CD8 + T (I). (J dan K) Fenotip memori pusat (Tcm), efektor (Teff) dan memori efektor (Tem) yang naif berdasarkan ekspresi CCR7 dan CD45RO. Imej perwakilan (kiri) dan data jadual (kanan) sel CD4 + T (J) dan sel CD8 + T (K) dalam asites dan tumor. Nilai P ditentukan oleh ujian-t berpasangan (*P<0.05, **P<0.01 dan ***P<0.001). Garis mewakili pesakit yang sepadan (n = 6). FMO, pendarfluor tolak satu; MFI, keamatan pendarfluor median.
Analisis lanjut mendedahkan perbezaan ketara lain antara status fenotip sel T yang sangat jelas. Memori yang diaktifkan (Rajah 1, G hingga I) dan efektor (Rajah 1, J dan K) dalam tumor adalah jauh lebih kerap daripada asites (perkadaran sel CD3 + T). Begitu juga, menganalisis fenotip melalui ekspresi penanda pengaktifan (CD25 dan CD137) dan penanda penipisan [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] menunjukkan bahawa walaupun ciri-ciri metabolik populasi ini berbeza (Rajah S1, B hingga E), tetapi tiada perbezaan metabolik yang ketara diperhatikan secara konsisten antara subset naif, efektor atau memori (Rajah S1, F hingga I). ​​Keputusan ini disahkan dengan menggunakan kaedah pembelajaran mesin untuk menetapkan fenotip sel secara automatik (21), yang selanjutnya mendedahkan kehadiran sebilangan besar sel sumsum tulang (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) dalam asites pesakit (Rajah S2A). Antara semua jenis sel yang dikenal pasti, populasi sel mieloid ini menunjukkan pengambilan glukosa dan aktiviti mitokondria tertinggi (Rajah S2, B hingga G). Keputusan ini menonjolkan perbezaan metabolik yang kuat antara pelbagai jenis sel yang terdapat dalam asites dan tumor dalam pesakit HGSC.
Cabaran utama dalam memahami ciri-ciri metabolisme TIL adalah keperluan untuk mengasingkan sampel sel T yang mempunyai ketulenan, kualiti dan kuantiti yang mencukupi daripada tumor. Kajian terbaru menunjukkan bahawa kaedah pengasingan dan pengayaan manik berdasarkan sitometri aliran boleh menyebabkan perubahan dalam profil metabolit selular (22-24). Untuk mengatasi masalah ini, kami mengoptimumkan kaedah pengayaan manik untuk mengasingkan dan mengasingkan TIL daripada kanser ovari manusia yang dibedah sebelum dianalisis oleh LC-MS/MS (lihat Bahan dan Kaedah; Rajah 2A). Untuk menilai impak keseluruhan protokol ini terhadap perubahan metabolit, kami membandingkan profil metabolit sel T yang diaktifkan oleh penderma yang sihat selepas langkah pemisahan manik di atas dengan sel yang tidak dipisahkan manik tetapi kekal di atas ais. Analisis kawalan kualiti ini mendapati bahawa terdapat korelasi yang tinggi antara kedua-dua keadaan ini (r = 0.77), dan kebolehulangan teknikal kumpulan 86 metabolit mempunyai kebolehulangan yang tinggi (Rajah 2B). Oleh itu, kaedah ini boleh melakukan analisis metabolit yang tepat dalam sel yang menjalani pengayaan jenis sel, justeru menyediakan platform resolusi tinggi pertama untuk mengenal pasti metabolit tertentu dalam HGSC, sekali gus membolehkan orang ramai memperoleh pemahaman yang lebih mendalam tentang kekhususan sel dalam program metabolisme Seksual.
(A) Gambarajah skematik pengayaan manik magnetik. Sebelum analisis oleh LC-MS/MS, sel-sel akan menjalani tiga pusingan pengayaan manik magnetik berturut-turut atau kekal di atas ais. (B) Kesan jenis pengayaan terhadap kelimpahan metabolit. Purata tiga ukuran untuk setiap jenis pengayaan ± SE. Garis kelabu mewakili hubungan 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) pengukuran berulang ditunjukkan dalam label paksi. NAD, nikotinamida adenina dinukleotida. (C) Gambarajah skematik aliran kerja analisis metabolit pesakit. Asites atau tumor dikumpulkan daripada pesakit dan dikrioawet. Sebahagian kecil daripada setiap sampel dianalisis melalui sitometri aliran, manakala sampel yang tinggal menjalani tiga pusingan pengayaan untuk sel CD4+, CD8+ dan CD45-. Pecahan sel ini dianalisis menggunakan LC-MS/MS. (D) Peta haba kelimpahan metabolit piawai. Dendrogram mewakili pengelompokan jarak Euclidean Ward antara sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) peta metabolit sampel, menunjukkan tiga replika setiap sampel, sampel daripada pesakit yang sama dihubungkan oleh garisan. (F) PCA profil metabolit sampel yang dikondisikan pada pesakit (iaitu, menggunakan redundansi separa); jenis sampel dihadkan oleh selubung cembung. PC1, komponen utama 1; PC2, komponen utama 2.
Seterusnya, kami menggunakan kaedah pengayaan ini untuk menganalisis 99 metabolit dalam pecahan sel CD4+, CD8+ dan CD45 dalam asites dan tumor primer enam pesakit HGSC (Rajah 2C, Rajah S3A dan Jadual S3 dan S4). Populasi yang dikaji menyumbang 2% hingga 70% daripada sampel besar asal sel hidup, dan perkadaran sel sangat berbeza antara pesakit. Selepas memisahkan manik, pecahan yang dikaji yang diperkaya (CD4+, CD8+ atau CD45-) menyumbang lebih daripada 85% daripada semua sel hidup dalam sampel secara purata. Kaedah pengayaan ini membolehkan kami menganalisis populasi sel daripada metabolisme tisu tumor manusia, yang mustahil dilakukan daripada sampel besar. Dengan menggunakan protokol ini, kami menentukan bahawa l-kynurenine dan adenosin, kedua-dua metabolit imunosupresif yang dicirikan dengan baik ini telah meningkat dalam sel T tumor atau sel tumor (Rajah S3, B dan C). Oleh itu, keputusan ini menunjukkan ketepatan dan keupayaan teknologi pemisahan sel dan spektrometri jisim kami untuk mencari metabolit yang penting secara biologi dalam tisu pesakit.
Analisis kami juga mendedahkan pemisahan metabolik yang kuat bagi jenis sel dalam dan antara pesakit (Rajah 2D dan Rajah S4A). Khususnya, berbanding dengan pesakit lain, pesakit 70 menunjukkan ciri-ciri metabolik yang berbeza (Rajah 2E dan Rajah S4B), menunjukkan bahawa mungkin terdapat heterogeniti metabolik yang ketara antara pesakit. Perlu diingatkan bahawa berbanding dengan pesakit lain (1.2 hingga 2 liter; Jadual S1), jumlah asites yang dikumpul dalam pesakit 70 (80 ml) adalah lebih kecil. Kawalan heterogeniti antara pesakit semasa analisis komponen utama (contohnya, menggunakan analisis redundansi separa) menunjukkan perubahan yang konsisten antara jenis sel, dan jenis sel dan/atau persekitaran mikro diagregatkan dengan jelas mengikut profil metabolit (Rajah 2F). Analisis metabolit tunggal menekankan kesan ini dan mendedahkan perbezaan yang ketara antara jenis sel dan persekitaran mikro. Perlu diingatkan bahawa perbezaan paling ekstrem yang diperhatikan ialah MNA, yang biasanya diperkaya dalam sel CD45- dan dalam sel CD4+ dan CD8+ yang menyusup ke dalam tumor (Rajah 3A). Bagi sel CD4+, kesan ini paling jelas, dan MNA dalam sel CD8+ juga nampaknya sangat dipengaruhi oleh persekitaran. Walau bagaimanapun, ini tidak penting, kerana hanya tiga daripada enam pesakit yang boleh dinilai untuk skor tumor CD8+. Selain MNA, dalam pelbagai jenis sel dalam asites dan tumor, metabolit lain yang kurang dicirikan dalam TIL juga kaya secara berbeza (Rajah S3 dan S4). Oleh itu, data ini mendedahkan satu set metabolit imunomodulatori yang menjanjikan untuk penyelidikan lanjut.
(A) Kandungan MNA yang dinormalisasi dalam sel CD4+, CD8+ dan CD45- daripada asites dan tumor. Plot kotak menunjukkan median (garis), julat antara kuartil (engsel bingkai) dan julat data, sehingga 1.5 kali ganda julat antara kuartil (kumis bingkai). Seperti yang diterangkan dalam Bahan dan Kaedah Pesakit, gunakan nilai limma pesakit untuk menentukan nilai P (*P<0.05 dan **P<0.01). (B) Gambarajah skematik metabolisme MNA (60). Metabolit: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-homosistein; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, nikotinamida mononukleotida. Enzim (hijau): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuin; NAMPT, nikotinamida fosforibosil transferase; AOX1, aldehid oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono Nukleotida adenilat transferase; Pnp1, fosforilase nukleosida purin. (C) t-SNE bagi scRNA-seq asites (kelabu) dan tumor (merah; n = 3 pesakit). (D) Ekspresi NNMT dalam populasi sel berbeza yang dikenal pasti menggunakan scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT dan AOX1 dalam SK-OV-3, buah pinggang embrio manusia (HEK) 293T, sel T dan sel T yang dirawat MNA. Ekspresi berlipat ditunjukkan relatif kepada SK-OV-3. Corak ekspresi dengan SEM ditunjukkan (n = 6 penderma sihat). Nilai Ct lebih besar daripada 35 dianggap tidak dapat dikesan (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 dan SLC22A2 dalam SK-OV-3, HEK293T, sel T dan sel T yang dirawat dengan 8mM MNA. Ekspresi berlipat ditunjukkan secara relatif kepada SK-OV-3. Corak ekspresi dengan SEM ditunjukkan (n = 6 penderma sihat). Nilai Ct yang lebih besar daripada 35 dianggap tidak dapat dikesan (UD). (G) Kandungan MNA sel dalam sel T penderma sihat yang diaktifkan selepas 72 jam pengeraman dengan MNA. Corak ekspresi dengan SEM ditunjukkan (n = 4 penderma sihat).
MNA dihasilkan dengan memindahkan kumpulan metil daripada S-adenosil-1-metionina (SAM) kepada nikotinamida (NA) oleh nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Rajah 3B). NNMT diekspres secara berlebihan dalam pelbagai jenis kanser manusia dan dikaitkan dengan percambahan, pencerobohan dan metastasis (25-27). Untuk lebih memahami sumber MNA dalam sel T dalam TME, kami menggunakan scRNA-seq untuk mencirikan ekspresi NNMT merentasi jenis sel dalam asites dan tumor tiga pesakit HGSC (Jadual S5). Analisis kira-kira 6,500 sel menunjukkan bahawa dalam persekitaran asites dan tumor, ekspresi NNMT terhad kepada populasi sel fibroblas dan tumor yang diandaikan (Rajah 3, C dan D). Perlu diingatkan bahawa tiada ekspresi NNMT yang jelas dalam mana-mana populasi yang mengekspresikan PTPRC (CD45 +) (Rajah 3D dan Rajah S5A), yang menunjukkan bahawa MNA yang dikesan dalam spektrum metabolit telah diperkenalkan ke dalam sel T. Ekspresi aldehid oksidase 1 (AOX1) menukarkan MNA kepada 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) atau 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); Rajah 3B) juga terhad kepada populasi fibroblas yang mengekspresikan COL1A1 (Rajah S5A), yang bersama-sama menunjukkan bahawa sel T kekurangan keupayaan metabolisme MNA konvensional. Corak ekspresi gen berkaitan MNA ini disahkan menggunakan set data sel bebas kedua daripada asites daripada pesakit HGSC (Rajah S5B; n = 6) (16). Di samping itu, analisis tindak balas rantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T penderma sihat yang dirawat dengan MNA menunjukkan bahawa berbanding dengan sel tumor ovari kawalan SK-OV-3, NNMT atau AOX1 hampir tidak diekspresikan (Rajah 3E). Keputusan yang tidak dijangka ini menunjukkan bahawa MNA mungkin dirembeskan daripada fibroblas atau tumor ke dalam sel T bersebelahan dalam TME.
Walaupun calon termasuk keluarga pengangkut kation organik 1 hingga 3 (OCT1, OCT2 dan OCT3) yang dikodkan oleh keluarga pembawa terlarut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 dan SLC22A3), pengangkut berpotensi MNA masih belum ditakrifkan (28). QPCR mRNA daripada sel T penderma yang sihat menunjukkan tahap ekspresi SLC22A1 yang rendah tetapi tahap SLC22A2 yang tidak dapat dikesan, yang mengesahkan bahawa ia telah dilaporkan sebelum ini dalam literatur (Rajah 3F) (29). Sebaliknya, barisan sel tumor ovari SK-OV-3 mengekspresikan tahap kedua-dua pengangkut yang tinggi (Rajah 3F).
Untuk menguji kemungkinan sel T mempunyai keupayaan untuk menyerap MNA asing, sel T penderma yang sihat telah dikultur selama 72 jam dengan kehadiran kepekatan MNA yang berbeza. Sekiranya tiada MNA eksogen, kandungan selular MNA tidak dapat dikesan (Rajah 3G). Walau bagaimanapun, sel T yang diaktifkan yang dirawat dengan MNA eksogen menunjukkan peningkatan kandungan MNA yang bergantung kepada dos dalam sel, sehingga 6 mM MNA (Rajah 3G). Keputusan ini menunjukkan bahawa walaupun tahap ekspresi pengangkut yang rendah dan kekurangan enzim utama yang bertanggungjawab untuk metabolisme MNA intraselular, TIL masih boleh mengambil MNA.
Spektrum metabolit dalam sel T pesakit dan eksperimen penyerapan MNA in vitro meningkatkan kemungkinan bahawa fibroblas berkaitan kanser (CAF) merembeskan MNA dan sel tumor mungkin mengawal fenotip dan fungsi TIL. Untuk menentukan kesan MNA pada sel T, sel T penderma yang sihat diaktifkan secara in vitro dengan kehadiran atau ketiadaan MNA, dan percambahan serta penghasilan sitokinnya dinilai. Selepas 7 hari penambahan MNA pada dos tertinggi, bilangan penggandaan populasi berkurangan secara sederhana, manakala semangat dikekalkan pada semua dos (Rajah 4A). Di samping itu, rawatan MNA eksogen mengakibatkan peningkatan dalam perkadaran sel T CD4+ dan CD8+ yang mengekspresikan faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Rajah 4B). Sebaliknya, penghasilan IFN-γ intraselular berkurangan dengan ketara dalam sel T CD4+, tetapi tidak dalam sel T CD8+, dan tiada perubahan ketara dalam interleukin 2 (IL-2; Rajah 4, C dan D). Oleh itu, ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA) supernatan daripada kultur sel T yang dirawat MNA ini menunjukkan peningkatan ketara dalam TNFα, penurunan dalam IFN-γ, dan tiada perubahan dalam IL-2 (Rajah 4, E hingga G). Penurunan IFN-γ menunjukkan bahawa MNA mungkin memainkan peranan dalam menghalang aktiviti anti-tumor sel T. Untuk mensimulasikan kesan MNA terhadap sitotoksisiti yang dimediasi sel T, sel reseptor antigen kimerik T (FRα-CAR-T) yang menyasarkan reseptor folat α dan sel CAR-T (GFP) yang dikawal selia oleh sel protein pendarfluor hijau (GFP) -CAR-T) dihasilkan oleh sel mononuklear darah periferal penderma yang sihat (PBMC). Sel CAR-T dikultur selama 24 jam dengan kehadiran MNA, dan kemudian dikultur bersama dengan sel tumor ovari SK-OV-3 manusia yang mengekspresikan reseptor folat α pada nisbah efektor kepada sasaran 10:1. Rawatan MNA mengakibatkan penurunan ketara dalam aktiviti pembunuhan sel FRα-CAR-T, yang serupa dengan sel FRα-CAR-T yang dirawat dengan adenosina (Rajah 4H).
(A) Jumlah kiraan sel yang berdaya maju dan penggandaan populasi (PD) secara langsung daripada kultur pada hari ke-7. Graf bar mewakili min + SEM bagi enam penderma yang sihat. Mewakili data daripada sekurang-kurangnya n = 3 eksperimen bebas. (B hingga D) CD3/CD28 dan IL-2 digunakan untuk mengaktifkan sel T pada kepekatan MNA masing-masing selama 7 hari. Sebelum analisis, sel telah dirangsang dengan PMA/ionomisin dengan GolgiStop selama 4 jam. Ekspresi TNFα (B) dalam sel T. Contoh imej (kiri) dan data jadual (kanan) ekspresi TNFα dalam sel hidup. Ekspresi IFN-γ (C) dan IL-2 (D) dalam sel T. Ekspresi sitokin diukur dengan sitometri aliran. Graf bar mewakili min (n = 6 penderma sihat) + SEM. Gunakan analisis varians sehala dan ukuran berulang (*P<0.05 dan **P<0.01) untuk menentukan nilai P. Mewakili data daripada sekurang-kurangnya n = 3 eksperimen bebas. (E hingga G) CD3/CD28 dan IL-2 digunakan untuk mengaktifkan sel T pada kepekatan MNA masing-masing selama 7 hari. Medium dikumpulkan sebelum dan selepas 4 jam rangsangan PMA/ionomisin. Kepekatan TNFα (E), IFN-γ (F) dan IL-2 (G) diukur dengan ELISA. Graf bar mewakili min (n = 5 penderma sihat) + SEM. Nilai P ditentukan menggunakan analisis varians sehala dan pengukuran berulang (*P<0.05). Garis putus-putus menunjukkan had pengesanan pengesanan. (H) Ujian lisis sel. Sel FRα-CAR-T atau GFP-CAR-T dilaraskan dengan adenosina (250μM) atau MNA (10 mM) selama 24 jam, atau dibiarkan tidak dirawat (Ctrl). Peratusan pembunuhan sel SK-OV-3 diukur. Nilai P ditentukan oleh ujian t Welch (*P<0.5 dan **P<0.01).
Untuk mendapatkan pemahaman mekanistik tentang pengawalaturan ekspresi TNFα yang bergantung kepada MNA, perubahan dalam mRNA TNFα bagi sel T yang dirawat MNA telah dinilai (Rajah 5A). Sel T penderma yang sihat yang dirawat dengan MNA menunjukkan peningkatan dua kali ganda dalam tahap transkripsi TNFα, menunjukkan bahawa MNA bergantung kepada pengawalaturan transkripsi TNFα. Untuk menyiasat mekanisme pengawalaturan yang mungkin ini, dua faktor transkripsi yang diketahui yang mengawal selia TNFα, iaitu faktor nuklear sel T yang diaktifkan (NFAT) dan protein khusus 1 (Sp1), telah dinilai sebagai tindak balas kepada pengikatan MNA pada promoter TNFα proksimal (30). Promoter TNFα mengandungi 6 tapak pengikatan NFAT yang dikenal pasti dan 2 tapak pengikatan Sp1, bertindih di satu tapak [-55 pasangan bes (bp) daripada 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) menunjukkan bahawa apabila dirawat dengan MNA, pengikatan Sp1 pada promoter TNFα meningkat tiga kali ganda. Penggabungan NFAT juga meningkat dan menghampiri kepentingan (Rajah 5B). Data ini menunjukkan bahawa MNA mengawal selia ekspresi TNFα melalui transkripsi Sp1, dan pada tahap yang lebih rendah, ekspresi NFAT.
(A) Berbanding dengan sel T yang dikultur tanpa MNA, perubahan lipatan ekspresi TNFα dalam sel T yang dirawat dengan MNA. Corak ekspresi dengan SEM ditunjukkan (n = 5 penderma sihat). Mewakili data daripada sekurang-kurangnya n = 3 eksperimen bebas. (B) Promoter TNFα sel T yang dirawat dengan atau tanpa 8 mM MNA selepas NFAT dan Sp1 digabungkan dengan (Ctrl) dan rangsangan PMA/ionomisin selama 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) dan H3 masing-masing digunakan sebagai kawalan negatif dan positif untuk imunopresipitasi. Kuantifikasi ChIP menunjukkan bahawa pengikatan Sp1 dan NFAT kepada promoter TNFα dalam sel yang dirawat MNA meningkat beberapa kali ganda berbanding dengan kawalan. Mewakili data daripada sekurang-kurangnya n = 3 eksperimen bebas. Nilai P ditentukan oleh berbilang ujian-t (*** P <0.01). (C) Berbanding dengan asites HGSC, sel T (bukan sitotoksik) menunjukkan peningkatan ekspresi TNF dalam tumor. Warna mewakili pesakit yang berbeza. Sel-sel yang dipaparkan telah disampel secara rawak kepada 300 dan digoncang untuk mengehadkan pengambilan berlebihan (** Padj = 0.0076). (D) Model MNA yang dicadangkan untuk kanser ovari. MNA dihasilkan dalam sel tumor dan fibroblas dalam TME dan diambil oleh sel T. MNA meningkatkan pengikatan Sp1 pada promoter TNFα, yang membawa kepada peningkatan transkripsi TNFα dan penghasilan sitokin TNFα. MNA juga menyebabkan penurunan IFN-γ. Perencatan fungsi sel T membawa kepada pengurangan keupayaan membunuh dan pertumbuhan tumor yang dipercepatkan.
Menurut laporan, TNFα mempunyai kesan anti-tumor dan anti-tumor yang bergantung kepada bahagian hadapan dan belakang, tetapi ia mempunyai peranan yang terkenal dalam menggalakkan pertumbuhan dan metastasis kanser ovari (31-33). Menurut laporan, kepekatan TNFα dalam asites dan tisu tumor pada pesakit kanser ovari adalah lebih tinggi daripada tisu jinak (34-36). Dari segi mekanisme, TNFα boleh mengawal selia pengaktifan, fungsi dan percambahan sel darah putih, dan mengubah fenotip sel kanser (37, 38). Selaras dengan penemuan ini, analisis ekspresi gen berbeza menunjukkan bahawa TNF meningkat dengan ketara dalam sel T dalam tisu tumor berbanding dengan asites (Rajah 5C). Peningkatan ekspresi TNF hanya jelas dalam populasi sel T dengan fenotip bukan sitotoksik (Rajah S5A). Secara ringkasnya, data ini menyokong pandangan bahawa MNA mempunyai kesan imunosupresif dan penggalak tumor berganda dalam HGSC.
Pelabelan pendarfluor berdasarkan sitometri aliran telah menjadi kaedah utama untuk mengkaji metabolisme TIL. Kajian-kajian ini menunjukkan bahawa berbanding dengan limfosit darah periferal atau sel T daripada organ limfoid sekunder, TIL murine dan manusia mempunyai kecenderungan yang lebih tinggi untuk mengambil glukosa (4, 39) dan kehilangan fungsi mitokondria secara beransur-ansur (19, 40). Walaupun kami telah melihat hasil yang serupa dalam kajian ini, perkembangan utama adalah untuk membandingkan metabolisme sel tumor dan TIL daripada tisu tumor yang sama yang telah dibedah. Selaras dengan beberapa laporan terdahulu ini, sel tumor (CD45-EpCAM +) daripada asites dan tumor mempunyai pengambilan glukosa yang lebih tinggi daripada sel T CD8 + dan CD4 +, yang menyokong bahawa pengambilan glukosa sel tumor yang tinggi boleh dibandingkan dengan sel T. Konsep persaingan sel T. TME. Walau bagaimanapun, aktiviti mitokondria sel tumor adalah lebih tinggi daripada sel T CD8 +, tetapi aktiviti mitokondria adalah serupa dengan sel T CD4 +. Keputusan ini mengukuhkan tema yang muncul bahawa metabolisme oksidatif adalah penting untuk sel tumor (41, 42). Mereka juga mencadangkan bahawa sel CD8 + T mungkin lebih mudah terdedah kepada disfungsi oksidatif berbanding sel CD4 + T, atau sel CD4 + T mungkin menggunakan sumber karbon selain glukosa untuk mengekalkan aktiviti mitokondria (43, 44). Perlu diingatkan bahawa kami tidak melihat perbezaan dalam pengambilan glukosa atau aktiviti mitokondria antara efektor CD4 + T, memori efektor T dan sel memori pusat T dalam asites. Begitu juga, keadaan pembezaan sel CD8 + T dalam tumor tidak ada kaitan dengan perubahan dalam pengambilan glukosa, yang menonjolkan perbezaan yang ketara antara sel T yang dikultur secara in vitro dan TIL manusia secara in vivo (22). Pemerhatian ini juga disahkan oleh penggunaan peruntukan populasi sel automatik yang tidak berat sebelah, yang selanjutnya mendedahkan bahawa sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + dengan pengambilan glukosa dan aktiviti mitokondria yang lebih tinggi daripada sel tumor adalah lazim tetapi mempunyai populasi sel aktif metabolik. Populasi ini mungkin mewakili subpopulasi putatif sel penindas myeloid atau sel dendritik plasmacytoid yang dikenal pasti dalam analisis scRNA-seq. Walaupun kedua-duanya telah dilaporkan dalam tumor ovari manusia [45], ia masih memerlukan kajian lanjut untuk menerangkan subpopulasi myeloid ini.
Walaupun kaedah berasaskan sitometri aliran dapat menjelaskan perbezaan umum dalam metabolisme glukosa dan oksidatif antara jenis sel, metabolit tepat yang dihasilkan oleh glukosa atau sumber karbon lain untuk metabolisme mitokondria dalam TME masih belum ditentukan. Menetapkan kehadiran atau ketiadaan metabolit kepada subset TIL tertentu memerlukan penulenan populasi sel daripada tisu yang dipotong. Oleh itu, kaedah pengayaan sel kami yang digabungkan dengan spektrometri jisim dapat memberikan pandangan tentang metabolit yang diperkaya secara berbeza dalam sel T dan populasi sel tumor dalam sampel pesakit yang sepadan. Walaupun kaedah ini mempunyai kelebihan berbanding penyisihan sel yang diaktifkan pendarfluor, perpustakaan metabolit tertentu mungkin terjejas disebabkan oleh kestabilan yang wujud dan/atau kadar perolehan yang cepat (22). Walau bagaimanapun, kaedah kami dapat mengenal pasti dua metabolit imunosupresif yang dikenali, adenosin dan kynurenin, kerana ia sangat berbeza antara jenis sampel.
Analisis metabolik kami terhadap tumor dan subjenis TIL memberikan lebih banyak pandangan tentang peranan metabolit dalam TME ovari. Pertama, menggunakan sitometri aliran, kami menentukan bahawa tiada perbezaan dalam aktiviti mitokondria antara tumor dan sel CD4 + T. Walau bagaimanapun, analisis LC-MS/MS mendedahkan perubahan ketara dalam kelimpahan metabolit di kalangan populasi ini, menunjukkan bahawa kesimpulan tentang metabolisme TIL dan aktiviti metabolik keseluruhannya memerlukan tafsiran yang teliti. Kedua, MNA ialah metabolit dengan perbezaan terbesar antara sel CD45 dan sel T dalam asites, bukan tumor. Oleh itu, pembahagian dan lokasi tumor mungkin mempunyai kesan yang berbeza pada metabolisme TIL, yang menonjolkan kemungkinan heterogeniti dalam persekitaran mikro tertentu. Ketiga, ekspresi enzim penghasil MNA NNMT terutamanya terhad kepada CAF, iaitu sel tumor pada tahap yang lebih rendah, tetapi tahap MNA yang boleh dikesan diperhatikan dalam sel T yang berasal dari tumor. Ekspresi berlebihan NNMT dalam CAF ovari mempunyai kesan penggalak kanser yang diketahui, sebahagiannya disebabkan oleh promosi metabolisme CAF, pencerobohan tumor dan metastasis (27). Walaupun tahap keseluruhan TIL adalah sederhana, ekspresi NNMT dalam CAF berkait rapat dengan subjenis mesenchymal Cancer Genome Atlas (TCGA), yang dikaitkan dengan prognosis yang buruk (27, 46, 47). Akhir sekali, ekspresi enzim AOX1 yang bertanggungjawab untuk degradasi MNA juga terhad kepada populasi CAF, yang menunjukkan bahawa sel T kekurangan keupayaan untuk memetabolismekan MNA. Keputusan ini menyokong idea bahawa walaupun kajian lanjut diperlukan untuk mengesahkan penemuan ini, tahap MNA yang tinggi dalam sel T mungkin menunjukkan kehadiran persekitaran mikro CAF imunosupresif.
Memandangkan tahap ekspresi pengangkut MNA yang rendah dan tahap protein utama yang tidak dapat dikesan yang terlibat dalam metabolisme MNA, kehadiran MNA dalam sel T adalah tidak dijangka. NNMT mahupun AOX1 tidak dapat dikesan melalui analisis scRNA-seq dan qPCR yang disasarkan bagi dua kohort bebas. Keputusan ini menunjukkan bahawa MNA tidak disintesis oleh sel T, tetapi diserap daripada TME di sekeliling. Eksperimen in vitro menunjukkan bahawa sel T cenderung untuk mengumpul MNA eksogen.
Kajian in vitro kami menunjukkan bahawa MNA eksogen mendorong ekspresi TNFα dalam sel T dan meningkatkan pengikatan Sp1 kepada promoter TNFα. Walaupun TNFα mempunyai fungsi anti-tumor dan anti-tumor, dalam kanser ovari, TNFα boleh menggalakkan pertumbuhan kanser ovari (31-33). Peneutralan TNFα dalam kultur sel tumor ovari atau penghapusan isyarat TNFα dalam model tikus boleh meningkatkan penghasilan sitokin keradangan yang dimediasi oleh TNFα dan menghalang pertumbuhan tumor (32, 35). Oleh itu, dalam kes ini, MNA yang berasal dari TME boleh bertindak sebagai metabolit pro-radang melalui mekanisme yang bergantung kepada TNFα melalui gelung autokrin, sekali gus menggalakkan kejadian dan penyebaran kanser ovari (31). Berdasarkan kemungkinan ini, sekatan TNFα sedang dikaji sebagai agen terapeutik yang berpotensi untuk kanser ovari (37, 48, 49). Di samping itu, MNA menjejaskan sitotoksisiti sel CAR-T kepada sel tumor ovari, memberikan bukti lanjut untuk penindasan imun yang dimediasi oleh MNA. Secara kolektif, keputusan ini mencadangkan model di mana tumor dan sel CAF merembeskan MNA ke dalam TME ekstraselular. Melalui (i) rangsangan pertumbuhan kanser ovari yang disebabkan oleh TNF dan (ii) perencatan aktiviti sitotoksik sel T yang disebabkan oleh MNA, ini mungkin mempunyai kesan tumor berganda (Rajah 5D).
Kesimpulannya, dengan menggunakan gabungan pengayaan sel pantas, penjujukan sel tunggal dan profil metabolik, kajian ini mendedahkan perbezaan imunometabolomik yang besar antara tumor dan sel asites dalam pesakit HGSC. Analisis komprehensif ini menunjukkan bahawa terdapat perbezaan dalam pengambilan glukosa dan aktiviti mitokondria antara sel T, dan mengenal pasti MNA sebagai metabolit pengawalseliaan imun autonomi bukan sel. Data ini memberi kesan kepada bagaimana TME mempengaruhi metabolisme sel T dalam kanser manusia. Walaupun persaingan langsung untuk nutrien antara sel T dan sel kanser telah dilaporkan, metabolit juga boleh bertindak sebagai pengawal selia tidak langsung untuk menggalakkan perkembangan tumor dan mungkin menyekat tindak balas imun endogen. Huraian lanjut tentang peranan fungsi metabolit pengawalseliaan ini boleh membuka strategi alternatif untuk meningkatkan tindak balas imun anti-tumor.
Spesimen dan data klinikal pesakit diperoleh melalui repositori tisu tumor kanser BC yang diperakui oleh Rangkaian Repositori Tisu Kanada. Menurut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Penyelidikan Kanser BC dan Universiti British Columbia (H07-00463), semua spesimen dan data klinikal pesakit memperoleh persetujuan bertulis yang termaklum atau secara rasmi mengetepikan persetujuan mereka. Sampel disimpan dalam BioBank yang diperakui (BRC-00290). Ciri-ciri pesakit yang terperinci ditunjukkan dalam Jadual S1 dan S5. Untuk kriopreservasi, pisau bedah digunakan untuk menguraikan sampel tumor pesakit secara mekanikal dan kemudian menolaknya melalui penapis 100 mikron untuk mendapatkan penggantungan sel tunggal. Asites pesakit disentrifugasi pada 1500 rpm selama 10 minit pada suhu 4°C untuk meleburkan sel dan mengeluarkan supernatan. Sel-sel yang diperoleh daripada tumor dan asites telah dikrioawet dalam 50% serum AB manusia yang dinyahaktifkan haba (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) dan 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal yang diawet ini telah dicairkan dan digunakan untuk metabolomik dan penentuan metabolit yang diterangkan di bawah.
Medium lengkap terdiri daripada 0.22 μm ditapis 50:50 ditambah RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) ditambah dengan 10% serum AB manusia yang dinyahaktifkan haba (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x larutan Penisilin Streptomisin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) dan 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) ditambah dengan 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) dan 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific). Penimbal pewarnaan sitometer aliran terdiri daripada 0.22 μm salin penimbal fosfat yang ditapis (PBS; Invitrogen) ditambah dengan 3% serum manusia AB yang dinyahaktifkan haba (Sigma). Penimbal pengayaan sel terdiri daripada PBS yang ditapis 0.22μm dan ditambah dengan serum AB manusia yang dinyahaktifkan haba 0.5% (Sigma-Aldrich).
Dalam medium lengkap 37°C, sel-sel telah diwarnakan dengan 10 nM MT DR dan 100 μM 2-NBDG selama 30 minit. Seterusnya, sel-sel telah diwarnakan dengan pewarna daya maju eF506 pada suhu 4°C selama 15 minit. Suspensikan semula sel-sel dalam Blok FC (eBioscience) dan Buffer Pewarna Brilliant (BD Biosciences), cairkan dalam penimbal pewarnaan sitometer aliran (mengikut arahan pengilang), dan inkubasi selama 10 minit pada suhu bilik. Warnakan sel-sel dengan satu set antibodi (Jadual S2) dalam penimbal pewarnaan sitometri aliran pada suhu 4°C selama 20 minit. Suspensikan semula sel-sel dalam penimbal pewarnaan sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) sebelum dianalisis. Gunakan SpectroFlo dan FlowJo V10 untuk menganalisis data kiraan sel, dan gunakan GraphPad Prism 8 untuk mencipta data. Keamatan pendarfluor median (MFI) bagi 2-NBDG dan MT DR telah dinormalisasikan secara log, dan kemudian ujian-t berpasangan digunakan untuk analisis statistik bagi mengambil kira pesakit yang sepadan. Alih keluar semua populasi dengan kurang daripada 40 peristiwa daripada analisis; masukkan nilai MFI sebanyak 1 untuk sebarang nilai negatif sebelum menjalankan analisis statistik dan visualisasi data.
Untuk menambah strategi pengawalan manual panel proses di atas, kami menggunakan anotasi penuh oleh pokok sekatan bentuk (FAUST) (21) untuk menetapkan sel secara automatik kepada populasi selepas menghapuskan sel mati dalam FlowJo. Kami menguruskan output secara manual untuk menggabungkan populasi yang nampaknya salah peruntukan (menggabungkan PD1+ dengan sel tumor PD1) dan populasi yang dikekalkan. Setiap sampel mengandungi purata lebih daripada 2% sel, untuk sejumlah 11 populasi.
Sentrifugasi ketumpatan kecerunan Ficoll digunakan untuk memisahkan PBMC daripada produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies). Sel T CD8 + telah diasingkan daripada PBMC menggunakan CD8 MicroBeads (Miltenyi) dan dikembangkan dalam medium lengkap menggunakan TransAct (Miltenyi) selama 2 minggu mengikut arahan pengilang. Sel-sel tersebut dibenarkan untuk berdiri selama 5 hari dalam medium lengkap yang mengandungi IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), dan kemudian dirangsang semula dengan TransAct. Pada hari ke-7, mengikut arahan pengilang, CD45 MicroBeads manusia (Miltenyi) telah digunakan untuk memperkayakan sel dalam tiga pusingan berturut-turut. Sel-sel tersebut telah diasingkan untuk analisis sitometri aliran (seperti yang diterangkan di atas), dan satu juta sel telah diasingkan tiga kali untuk analisis LC-MS/MS. Sampel diproses oleh LC-MS/MS seperti yang diterangkan di bawah. Kami menganggarkan nilai metabolit yang hilang dengan nombor ion 1,000. Setiap sampel dinormalisasikan oleh jumlah nombor ion (TIC), ditukar secara logaritma dan dinormalisasikan secara automatik dalam MetaboAnalystR sebelum analisis.
Suspensi sel tunggal setiap pesakit telah dicairkan dan ditapis melalui penapis 40 μm ke dalam medium lengkap (seperti yang diterangkan di atas). Menurut protokol pengilang, tiga pusingan pemilihan positif berturut-turut melalui pemisahan manik magnetik menggunakan MicroBeads (Miltenyi) telah digunakan untuk memperkayakan sampel untuk sel CD8+, CD4+ dan CD45- (di atas ais). Pendek kata, sel-sel tersebut digantung semula dalam penimbal pengayaan sel (seperti yang diterangkan di atas) dan dikira. Sel-sel tersebut diinkubasi dengan manik CD8 manusia, manik CD4 manusia atau manik CD45 manusia (Miltenyi) pada suhu 4°C selama 15 minit, dan kemudian dibasuh dengan penimbal pengayaan sel. Sampel dilalukan melalui lajur LS (Miltenyi), dan pecahan positif dan negatif dikumpulkan. Untuk mengurangkan tempoh dan memaksimumkan langkah pemulihan sel, pecahan CD8 kemudiannya digunakan untuk pusingan kedua pengayaan CD4+, dan pecahan CD4 digunakan untuk pengayaan CD45 berikutnya. Pastikan larutan berada di atas ais sepanjang proses pemisahan.
Untuk menyediakan sampel bagi analisis metabolit, sel-sel dibasuh sekali dengan larutan garam sejuk beku, dan 1 ml metanol 80% ditambah kepada setiap sampel, kemudian divorteks dan dibekukan dalam nitrogen cecair. Sampel telah menjalani tiga kitaran beku-cair dan disentrifugasi pada 14,000 rpm selama 15 minit pada suhu 4°C. Supernatan yang mengandungi metabolit disejat sehingga kering. Metabolit dilarutkan semula dalam 50 μl asid formik 0.03%, divorteks untuk dicampur, dan kemudian disentrifugasi untuk membuang serpihan.
Ekstrak metabolit seperti yang diterangkan di atas. Pindahkan supernatan ke dalam botol kromatografi cecair berprestasi tinggi untuk penyelidikan metabolomik. Gunakan protokol rawatan rawak untuk merawat setiap sampel dengan bilangan sel yang sama bagi mengelakkan kesan kelompok. Kami menjalankan penilaian kualitatif metabolit global yang sebelum ini diterbitkan pada Spektrometer Jisim Kuadrupole Tiga Kali Ganda AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Analisis kromatografi dan integrasi kawasan puncak telah dilakukan menggunakan perisian MultiQuant versi 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Kiraan ion sebanyak 1000 telah digunakan untuk menganggarkan nilai metabolit yang hilang, dan TIC setiap sampel telah digunakan untuk mengira luas puncak ternormalisasi bagi setiap metabolit yang dikesan untuk membetulkan perubahan yang diperkenalkan oleh analisis instrumental daripada pemprosesan sampel. Selepas TIC dinormalisasi, MetaboAnalystR(51) (parameter lalai) digunakan untuk penukaran logaritma dan penskalaan garis norma automatik. Kami menggunakan PCA dengan pakej vegan R untuk menjalankan analisis penerokaan perbezaan metabolit antara jenis sampel, dan menggunakan analisis redundansi separa untuk menganalisis pesakit. Gunakan kaedah Ward untuk membina dendrogram peta haba untuk mengelompokkan jarak Euclidean antara sampel. Kami menggunakan limma (52) pada kelimpahan metabolit piawai untuk mengenal pasti metabolit yang berbeza secara berlimpah merentasi keseluruhan jenis sel dan persekitaran mikro. Untuk memudahkan penjelasan, kami menggunakan parameter min kumpulan untuk menentukan model, dan mempertimbangkan jenis sel dalam persekitaran mikro sebagai setiap kumpulan (n = 6 kumpulan); untuk ujian kepentingan, kami melakukan tiga pengukuran berulang untuk setiap metabolit. Untuk mengelakkan replikasi palsu, pesakit dimasukkan sebagai halangan dalam reka bentuk limma. Untuk menyemak perbezaan metabolit antara pesakit yang berbeza, kami melaraskan model limma yang merangkumi pesakit dengan cara yang tetap. Kami melaporkan kepentingan kontras yang telah ditentukan terlebih dahulu antara jenis sel dan persekitaran mikro Padj <0.05 (pembetulan Benjamini-Hochberg).
Selepas pengayaan semangat menggunakan Kit Penyingkiran Sel Mati Miltenyi (daya maju >80%), penjujukan transkriptom sel tunggal telah dilakukan pada jumlah sampel asites dan tumor beku hidup menggunakan protokol ekspresi gen 10x 5′. Lima kes dengan tumor dan asites yang sepadan telah dianalisis, walaupun daya maju yang rendah daripada satu sampel tumor menghalang kemasukannya. Untuk mencapai pelbagai pilihan pesakit, kami menggabungkan sampel setiap pesakit di lorong pengawal kromium 10x, dan menganalisis asites dan tapak tumor secara berasingan. Selepas penjujukan [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp hujung berpasangan (PE), genom Quebec; purata bacaan setiap sel untuk tumor dan asites masing-masing]], kami menggunakan CellSNP dan Vireo (53) (berdasarkan CellSNP sebagai SNP manusia biasa (VCF) yang disediakan oleh GRCh38 diberikan identiti penderma. Kami menggunakan SNPRelate untuk membuat kesimpulan identiti terdekat (IBS) status genotip pesakit (IBS), tidak termasuk sel yang tidak ditugaskan dan sel yang dikenal pasti sebagai dupleks dan penderma yang sepadan antara asites dan sampel tumor (54). Berdasarkan tugasan ini, kami mengekalkan tiga kes dengan perwakilan sel yang banyak dalam tumor dan asites untuk analisis hiliran. Selepas melakukan langkah penapisan jisim dalam pembungkusan BioConductor scater (55) dan scran (56), ini menghasilkan 6975 sel (masing-masing 2792 dan 4183 sel daripada tumor dan asites) untuk analisis. Kami menggunakan pengelompokan Louvain igraph (57) bagi rangkaian jiran terdekat yang dikongsi (SNN) berdasarkan jarak Jaccard ke sel kluster mengikut ekspresi. Kelompok-kelompok tersebut telah dianotasi secara manual kepada jenis sel putatif berdasarkan ekspresi gen penanda dan divisualisasikan dengan t-SNE. Sel T sitotoksik ditakrifkan oleh ekspresi CD8A dan GZMA, tidak termasuk subkelompok dengan ekspresi protein ribosom yang rendah. Kami mengakses data yang diterbitkan oleh Izar et al. (16), termasuk penyematan t-SNE mereka, yang boleh mengawal pertindihan ekspresi antara penanda sel imun dan ekspresi NNMT.
PBMC telah diasingkan daripada produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) melalui sentrifugasi ketumpatan kecerunan Ficoll. Sel CD3+ telah diasingkan daripada PBMC menggunakan manik CD3 (Miltenyi). Dengan kehadiran atau ketiadaan MNA, sel CD3+ telah diaktifkan dengan CD3 terikat plat (5μg/ml), CD28 larut (3μg/ml) dan IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Pada hari terakhir pengembangan, daya maju (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) dan percambahan (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) telah dinilai melalui sitometri aliran. Nilaikan fungsi efektor dengan merangsang sel dengan PMA (20 ng/ml) dan ionomisin (1μg/ml) dengan GolgiStop selama 4 jam, dan pantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) dan TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Rangsang sel qPCR dan ChIP dengan PMA (20 ng/ml) dan ionomisin (1μg/ml) selama 4 jam. Supernatan ELISA dikumpulkan sebelum dan selepas rangsangan dengan PMA (20 ng/ml) dan ionomisin (1 μg/ml) selama 4 jam.
Ikut protokol pengilang untuk mengasingkan RNA menggunakan Kit Mini RNeasy Plus (QIAGEN). Gunakan QIAshredder (QIAGEN) untuk menghomogenkan sampel. Gunakan kit RNA kepada cDNA berkapasiti tinggi (Thermo Fisher Scientific) untuk mensintesis DNA pelengkap (cDNA). Gunakan TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) untuk mengukur ekspresi gen (mengikut protokol pengilang) dengan prob berikut: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldehid-3-fosfat daripada Hidrogen (GAPDH)] dan Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sampel telah dijalankan pada sistem PCR masa nyata StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) dalam plat tindak balas 96-telaga optik pantas MicroAmp (Applied Biosystems) dengan filem optik MicroAmp. Sebarang nilai Ct yang melebihi 35 dianggap melebihi ambang pengesanan dan ditanda sebagai tidak dapat dikesan.
Lakukan ChIP seperti yang diterangkan sebelum ini (58). Pendek kata, sel-sel telah dirawat dengan formaldehid (kepekatan akhir 1.42%) dan diinkubasi pada suhu bilik selama 10 minit. Gunakan penimbal pembengkakan tambahan (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl dan 0.1% NP-40) di atas ais selama 10 minit, kemudian gantungkan semula dalam penimbal imunopresipitasi seperti yang diterangkan (58). Sampel kemudiannya disonikasi dengan kitaran berikut: 10 kitaran (20 denyutan 1 saat) dan masa statik selama 40 saat. Inkubasi antibodi imunoglobulin G gred ChIP (Teknologi Isyarat Sel; 1μl), histon H3 (Teknologi Isyarat Sel; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) dan SP1 (Teknologi Isyarat Sel; 3μl) dengan sampel pada goncangan 4°CC semalaman. Inkubasi manik protein A (Thermo Fisher Scientific) dengan sampel pada suhu 4°C dengan goncangan lembut selama 1 jam, kemudian gunakan manik chelex (Bio-Rad) untuk memperkayakan DNA, dan gunakan proteinase K (Thermo Fisher) untuk pencernaan protein. Promoter TNFα dikesan melalui PCR: ke hadapan, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sebaliknya, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produk 207-bp). Imej dihasilkan oleh Image Lab (Bio-Rad) dan diukur menggunakan perisian ImageJ.
Supernatan kultur sel telah dikumpulkan seperti yang diterangkan di atas. Penentuan telah dijalankan mengikut prosedur pengilang iaitu kit ELISA TNFα manusia (Invitrogen), kit ELISA IL-2 manusia (Invitrogen) dan kit ELISA IFN-γ manusia (Abcam). Mengikut protokol pengilang, supernatan telah dicairkan 1:100 untuk mengesan TNFα dan IL-2, dan 1:3 untuk mengesan IFN-γ. Gunakan Pembaca Berbilang Label EnVision 2104 (PerkinElmer) untuk mengukur penyerapan pada 450 nm.
PBMC telah diasingkan daripada produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) melalui sentrifugasi ketumpatan kecerunan Ficoll. Sel CD3+ telah diasingkan daripada PBMC menggunakan manik CD3 (Miltenyi). Dengan kehadiran atau ketiadaan MNA, sel CD3+ telah diaktifkan dengan CD3 terikat plat (5μg/ml), CD28 larut (3μg/ml) dan IL-2 (300 U/ml; Proleukin) selama 3 hari. Selepas 3 hari, sel-sel telah dikumpulkan dan dibasuh dengan larutan garam 0.9%, dan pelet telah dibekukan seketika. Kiraan sel telah dilakukan melalui sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) menggunakan 123count eBeads.
Ekstrak metabolit seperti yang diterangkan di atas. Ekstrak kering telah dibentuk semula pada kepekatan 4000 sel setara/μl. Analisis sampel melalui kromatografi fasa terbalik (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) dan lajur CORTECS T3 (2.1×150 mm, saiz zarah 1.6-μm, saiz liang 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometer jisim kutub (6470, Agilent), di mana pengionan elektrosemburan beroperasi dalam mod positif. Fasa bergerak A ialah 0.1% asid formik (dalam H2O), fasa bergerak B ialah 90% asetonitril, 0.1% asid formik. Kecerunan LC ialah 0 hingga 2 minit untuk 100% A, 2 hingga 7.1 minit untuk 99% B, dan 7.1 hingga 8 minit untuk 99% B. Kemudian seimbangkan semula lajur dengan fasa bergerak A pada kadar aliran 0.6 ml/min selama 3 minit. Kadar aliran ialah 0.4ml/min, dan ruang lajur dipanaskan hingga 50°C. Gunakan piawaian kimia tulen MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) untuk menentukan masa pengekalan (RT) dan transformasi (RT = 0.882 minit, transformasi 1 = 137→94.1, transformasi 2 = 137→92, Penukaran 3 = 137→78). Apabila ketiga-tiga peralihan berlaku pada masa pengekalan yang betul, peralihan 1 digunakan untuk kuantifikasi bagi memastikan kekhususan. Lengkung piawai MNA (Toronto Research Chemical Company) dijana melalui enam pencairan bersiri larutan stok (1 mg/ml) untuk mendapatkan piawai cecair 0.1, 1.0, 10 dan 100 ng/ml dan 1.0 dan 10μg/ml. Had pengesanan ialah 1 ng/ml, dan tindak balas linear adalah antara 10 ng/ml dan 10μg/ml. Setiap suntikan dua mikroliter sampel dan piawai digunakan untuk analisis LC/MS, dan sampel kawalan kualiti campuran dijalankan setiap lapan suntikan untuk memastikan kestabilan platform analisis. Tindak balas MNA bagi semua sampel sel yang dirawat MNA berada dalam julat linear ujian. Analisis data dilakukan menggunakan perisian analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruk αFR-CAR generasi kedua diambil daripada Song et al. (59). Secara ringkasnya, konstruk tersebut mengandungi kandungan berikut: jujukan pemimpin CD8a, serpihan pembolehubah rantai tunggal khusus αFR manusia, kawasan engsel dan transmembran CD8a, domain intraselular CD27 dan domain intraselular CD3z. Jujukan CAR lengkap disintesis oleh GenScript, dan kemudian diklonkan ke dalam vektor ekspresi lentiviral generasi kedua di hulu kaset ekspresi GFP yang digunakan untuk menilai kecekapan transduksi.
Lentivirus dihasilkan melalui transfeksi sel HEK293T [Koleksi Kultur Jenis Amerika (ATCC); ditumbuhkan dalam medium Eagle yang diubah suai Dulbecco yang mengandungi 10% serum lembu janin (FBS) dan 1% PenStrep, dan menggunakan vektor CAR-GFP dan plasmid pembungkusan (psPAX2 dan pMD2.G, Addgene) menggunakan lipofeksi amina (Sigma-Aldrich). Supernatan yang mengandungi virus dikumpulkan 48 dan 72 jam selepas transfeksi, ditapis dan dipekatkan melalui ultrasentrifugasi. Simpan supernatan virus pekat pada -80°C sehingga transduksi.
PBMC diasingkan daripada produk pemisahan leukosit penderma yang sihat (STEMCELL Technologies) melalui sentrifugasi ketumpatan kecerunan Ficoll. Gunakan manik mikro CD8 pemilihan positif (Miltenyi) untuk mengasingkan sel CD8+ daripada PBMC. Rangsang sel T dengan TransAct (Miltenyi) dan dalam medium TexMACS [Miltenyi; ditambah dengan 3% serum manusia yang dinyahaktifkan haba, 1% PenStrep dan IL-2 (300 U/ml)]. Dua puluh empat jam selepas rangsangan, sel T ditransduksi dengan lentivirus (10 μl supernatan virus pekat setiap 106 sel). 1 hingga 3 hari selepas transduksi pada Cytek Aurora (pada FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), nilaikan ekspresi GFP sel untuk menunjukkan kecekapan transduksi sekurang-kurangnya 30%.
Sel CAR-T dikultur selama 24 jam dalam Immunocult (STEMCELL Technologies; ditambah dengan 1% PenStrep) di bawah keadaan berikut: tidak dirawat, dirawat dengan 250 μM adenosina atau 10 mM MNA. Selepas prarawatan, sel CAR-T dibasuh dengan PBS dan digabungkan dengan 20,000 sel SK-OV-3 [ATCC; dalam medium McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ditambah dengan 10% FBS dan 1% PenStrep pada 10: Nisbah efektor kepada sasaran 1 telah dikuatkan dalam tiga kali ganda dalam medium Immunocult tambahan. Sel SK-OV-3 dan sel SK-OV-3 yang dilisiskan dengan saponin digitalis (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) masing-masing digunakan sebagai kawalan negatif dan positif. Selepas 24 jam penanaman bersama, supernatan dikumpulkan dan laktat dehidrogenase (LDH) diukur mengikut arahan pengilang (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatan LDH dicairkan 1:50 dalam penimbal LDH. Peratusan pembunuhan diukur menggunakan formula berikut: peratusan pembunuhan = peratusan pembetulan / kadar pembunuhan maksimum x 100%, yang mana peratusan pembetulan = kultur bersama-sel T sahaja, dan kadar pembunuhan maksimum = kawalan positif-kawalan negatif.
Seperti yang diterangkan dalam teks atau bahan dan kaedah, gunakan GraphPad Prism 8, Microsoft Excel atau R v3.6.0 untuk analisis statistik. Jika berbilang sampel dikumpulkan daripada pesakit yang sama (seperti asites dan tumor), kami menggunakan ujian-t berpasangan atau memasukkan pesakit sebagai kesan rawak dalam model linear atau umum yang sesuai. Untuk analisis metabolomik, ujian kepentingan dilakukan dalam tiga kali ganda.
Untuk bahan tambahan bagi artikel ini, sila lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ini merupakan artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah terma Lesen Creative Commons Atribusi-Bukan-Komersial, yang membenarkan penggunaan, pengedaran dan penghasilan semula dalam sebarang medium, selagi penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah karya asal adalah betul. Rujukan.
Nota: Kami hanya meminta anda memberikan alamat e-mel anda supaya orang yang anda cadangkan ke halaman tersebut tahu bahawa anda mahu mereka melihat e-mel tersebut dan ia bukan spam. Kami tidak akan merekodkan sebarang alamat e-mel.
Soalan ini digunakan untuk menguji sama ada anda seorang pelawat dan mencegah penyerahan spam automatik.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (Ralph J. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA menyumbang kepada penindasan imun sel T dan mewakili sasaran imunoterapi yang berpotensi untuk rawatan kanser manusia.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (Ralph J. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA menyumbang kepada penindasan imun sel T dan mewakili sasaran imunoterapi yang berpotensi untuk rawatan kanser manusia.
©2021 American Association for the Advancement of Science. semua hak terpelihara. AAAS ialah rakan kongsi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.