Asid propionik (PPA), agen antikulat dan bahan tambahan diet biasa, telah terbukti menyebabkan perkembangan saraf yang tidak normal pada tikus yang disertai dengan disfungsi gastrousus, yang mungkin disebabkan oleh disbiosis usus. Hubungan antara pendedahan PPA diet dan disbiosis mikrobiota usus telah dicadangkan, tetapi belum disiasat secara langsung. Di sini, kami menyiasat perubahan berkaitan PPA dalam komposisi mikrobiota usus yang boleh menyebabkan disbiosis. Mikrobiom usus tikus yang diberi diet yang tidak dirawat (n=9) dan diet yang diperkaya PPA (n=13) telah dijujukan menggunakan penjujukan metagenomik jarak jauh untuk menilai perbezaan dalam komposisi mikrob dan laluan metabolik bakteria. PPA diet dikaitkan dengan peningkatan dalam kelimpahan taksa yang ketara, termasuk beberapa spesies Bacteroides, Prevotella, dan Ruminococcus, yang mana ahlinya sebelum ini telah terlibat dalam pengeluaran PPA. Mikrobiom tikus yang terdedah kepada PPA juga mempunyai lebih banyak laluan yang berkaitan dengan metabolisme lipid dan biosintesis hormon steroid. Keputusan kami menunjukkan bahawa PPA boleh mengubah mikrobiota usus dan laluan metabolik yang berkaitan dengannya. Perubahan yang diperhatikan ini menunjukkan bahawa bahan pengawet yang dikelaskan sebagai selamat untuk dimakan boleh mempengaruhi komposisi mikrobiota usus dan seterusnya, kesihatan manusia. Antaranya, P, G atau S dipilih bergantung pada tahap pengelasan yang dianalisis. Untuk meminimumkan kesan pengelasan positif palsu, ambang kelimpahan relatif minimum 1e-4 (1/10,000 bacaan) telah diguna pakai. Sebelum analisis statistik, kelimpahan relatif yang dilaporkan oleh Bracken (jumlah_pecahan_bacaan) telah diubah menggunakan transformasi nisbah log berpusat (CLR) (Aitchison, 1982). Kaedah CLR dipilih untuk transformasi data kerana ia tidak berubah skala dan mencukupi untuk set data bukan jarang (Gloor et al., 2017). Transformasi CLR menggunakan logaritma semula jadi. Data kiraan yang dilaporkan oleh Bracken telah dinormalisasi menggunakan ungkapan log relatif (RLE) (Anders dan Huber, 2010). Angka dijana menggunakan gabungan matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 dan logaritma berjujukan (Gloor et al., 2017). 0.12.2 dan nota satah v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Nisbah Bacillus/Bacteroidetes dikira untuk setiap sampel menggunakan kiraan bakteria ternormalisasi. Nilai yang dilaporkan dalam jadual dibundarkan kepada 4 tempat perpuluhan. Indeks kepelbagaian Simpson dikira menggunakan skrip alpha_diversity.py yang disediakan dalam pakej KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Laporan Bracken disediakan dalam skrip dan indeks Simpson “Si” disediakan untuk parameter -an. Perbezaan ketara dalam kelimpahan ditakrifkan sebagai perbezaan min CLR ≥ 1 atau ≤ -1. Perbezaan min CLR ±1 menunjukkan peningkatan 2.7 kali ganda dalam kelimpahan jenis sampel. Tanda (+/-) menunjukkan sama ada takson lebih banyak dalam sampel PPA dan sampel kawalan, masing-masing. Kepentingan ditentukan menggunakan ujian Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). Statsmodels lwn. 0.14 (Benjamini dan Hochberg, 1995; Seabold dan Perktold, 2010) telah digunakan, dan prosedur Benjamini-Hochberg telah digunakan untuk membetulkan ujian berganda. Nilai-p yang diselaraskan ≤ 0.05 telah digunakan sebagai ambang untuk menentukan kepentingan statistik.
Mikrobiom manusia sering dirujuk sebagai "organ terakhir badan" dan memainkan peranan penting dalam kesihatan manusia (Baquero dan Nombela, 2012). Khususnya, mikrobiom usus dikenali kerana pengaruh dan peranannya di seluruh sistem dalam banyak fungsi penting. Bakteria komensal banyak terdapat di usus, menduduki pelbagai niche ekologi, menggunakan nutrien, dan bersaing dengan patogen yang berpotensi (Jandhyala et al., 2015). Komponen bakteria mikrobiota usus yang pelbagai mampu menghasilkan nutrien penting seperti vitamin dan menggalakkan pencernaan (Rowland et al., 2018). Metabolit bakteria juga telah terbukti mempengaruhi perkembangan tisu dan meningkatkan laluan metabolik dan imun (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Komposisi mikrobiom usus manusia sangat pelbagai dan bergantung pada faktor genetik dan persekitaran seperti diet, jantina, ubat-ubatan, dan status kesihatan (Kumbhare et al., 2019).
Pemakanan ibu merupakan komponen penting dalam perkembangan janin dan neonatal dan merupakan sumber sebatian yang boleh mempengaruhi perkembangan (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Salah satu sebatian yang menarik perhatian ialah asid propionik (PPA), hasil sampingan asid lemak rantai pendek yang diperoleh daripada penapaian bakteria dan bahan tambahan makanan (den Besten et al., 2013). PPA mempunyai sifat antibakteria dan antikulat dan oleh itu digunakan sebagai pengawet makanan dan dalam aplikasi perindustrian untuk menghalang pertumbuhan kulat dan bakteria (Wemmenhove et al., 2016). PPA mempunyai kesan yang berbeza dalam tisu yang berbeza. Di dalam hati, PPA mempunyai kesan anti-radang dengan mempengaruhi ekspresi sitokin dalam makrofaj (Kawasoe et al., 2022). Kesan pengawalaturan ini juga telah diperhatikan dalam sel imun lain, yang membawa kepada penurunan regulasi keradangan (Haase et al., 2021). Walau bagaimanapun, kesan sebaliknya telah diperhatikan di otak. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa pendedahan PPA mendorong tingkah laku seperti autisme pada tikus (El-Ansary et al., 2012). Kajian lain menunjukkan bahawa PPA boleh menyebabkan gliosis dan mengaktifkan laluan pro-radang di otak (Abdelli et al., 2019). Oleh kerana PPA adalah asid lemah, ia boleh meresap melalui epitelium usus ke dalam aliran darah dan dengan itu melintasi halangan restriktif termasuk penghalang darah-otak serta plasenta (Stinson et al., 2019), menonjolkan kepentingan PPA sebagai metabolit pengawalseliaan yang dihasilkan oleh bakteria. Walaupun peranan PPA yang berpotensi sebagai faktor risiko autisme sedang disiasat, kesannya terhadap individu yang menghidap autisme mungkin melangkaui sekadar mendorong pembezaan saraf.
Simptom gastrousus seperti cirit-birit dan sembelit adalah perkara biasa pada pesakit yang mengalami gangguan perkembangan saraf (Cao et al., 2021). Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa mikrobiom pesakit dengan gangguan spektrum autisme (ASD) berbeza daripada individu yang sihat, menunjukkan kehadiran disbiosis mikrobiota usus (Finegold et al., 2010). Begitu juga, ciri-ciri mikrobiom pesakit dengan penyakit radang usus, obesiti, penyakit Alzheimer, dan sebagainya juga berbeza daripada individu yang sihat (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Walau bagaimanapun, setakat ini, tiada hubungan kausal telah diwujudkan antara mikrobiom usus dan penyakit atau simptom neurologi (Yap et al., 2021), walaupun beberapa spesies bakteria dianggap memainkan peranan dalam beberapa keadaan penyakit ini. Contohnya, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio dan genera lain lebih banyak terdapat dalam mikrobiota pesakit autisme (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Terutamanya, spesies ahli bagi beberapa genera ini diketahui mempunyai gen yang berkaitan dengan penghasilan PPA (Reichardt et al., 2014; Yun dan Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur dan Dürre, 2023). Memandangkan sifat antimikrob PPA, peningkatan kelimpahannya mungkin bermanfaat untuk pertumbuhan bakteria penghasil PPA (Jacobson et al., 2018). Oleh itu, persekitaran yang kaya dengan PFA boleh menyebabkan perubahan dalam mikrobiota usus, termasuk patogen gastrousus, yang mungkin merupakan faktor berpotensi yang membawa kepada gejala gastrousus.
Persoalan utama dalam penyelidikan mikrobiom ialah sama ada perbezaan dalam komposisi mikrob merupakan punca atau simptom penyakit yang mendasari. Langkah pertama ke arah menjelaskan hubungan kompleks antara diet, mikrobiom usus dan penyakit neurologi adalah untuk menilai kesan diet terhadap komposisi mikrob. Untuk tujuan ini, kami menggunakan penjujukan metagenomik yang telah dibaca panjang untuk membandingkan mikrobiom usus anak tikus yang diberi diet kaya PPA atau kurang PPA. Anak-anak tikus diberi diet yang sama seperti ibu mereka. Kami membuat hipotesis bahawa diet kaya PPA akan mengakibatkan perubahan dalam komposisi mikrob usus dan laluan fungsi mikrob, terutamanya yang berkaitan dengan metabolisme PPA dan/atau penghasilan PPA.
Kajian ini menggunakan tikus transgenik FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) yang mengekspres protein pendarfluor hijau (GFP) secara berlebihan di bawah kawalan promoter GFAP khusus glia mengikut garis panduan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Florida Tengah (UCF-IACUC) (Nombor Permit Penggunaan Haiwan: PROTO202000002). Selepas penyapihan, tikus ditempatkan secara individu dalam sangkar dengan 1–5 tikus setiap jantina setiap sangkar. Tikus diberi makan secara ad libitum sama ada diet kawalan yang telah ditulenkan (diet standard label terbuka yang diubah suai, 16 kcal% lemak) atau diet tambahan natrium propionat (diet standard label terbuka yang diubah suai, 16 kcal% lemak, mengandungi 5,000 ppm natrium propionat). Jumlah natrium propionat yang digunakan adalah bersamaan dengan 5,000 mg PFA/kg jumlah berat makanan. Ini adalah kepekatan PPA tertinggi yang diluluskan untuk digunakan sebagai pengawet makanan. Sebagai persediaan untuk kajian ini, tikus induk diberi kedua-dua diet selama 4 minggu sebelum mengawan dan diteruskan sepanjang kehamilan induk. Tikus keturunan [22 tikus, 9 kawalan (6 jantan, 3 betina) dan 13 PPA (4 jantan, 9 betina)] disapih dan kemudian diteruskan dengan diet yang sama seperti induk selama 5 bulan. Tikus keturunan dikorbankan pada usia 5 bulan dan kandungan najis usus mereka dikumpulkan dan pada mulanya disimpan dalam tiub mikroempar 1.5 ml pada suhu -20°C dan kemudian dipindahkan ke peti sejuk beku -80°C sehingga DNA perumah berkurangan dan asid nukleik mikrob diekstrak.
DNA perumah telah dibuang mengikut protokol yang diubah suai (Charalampous et al., 2019). Secara ringkas, kandungan najis dipindahkan ke 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) dan disimpan beku. Proses maksimum 1-2 pelet najis setiap pengekstrakan. Kandungan najis kemudiannya dihomogenkan secara mekanikal menggunakan alu plastik di dalam tiub untuk membentuk buburan. Sentrifugasi sampel pada 10,000 RCF selama 5 minit atau sehingga sampel telah mengembang, kemudian sedut supernatan dan gantungkan semula pelet dalam 250 µl 1× PBS. Tambahkan 250 µl larutan saponin 4.4% (TCI, nombor produk S0019) ke dalam sampel sebagai detergen untuk melonggarkan membran sel eukariotik. Sampel dicampur perlahan-lahan sehingga sebati dan diinkubasi pada suhu bilik selama 10 minit. Seterusnya, untuk mengganggu sel eukariotik, 350 μl air bebas nuklease telah ditambah ke dalam sampel, diinkubasi selama 30 saat, dan kemudian 12 μl 5 M NaCl telah ditambah. Sampel kemudiannya disentrifugasi pada 6000 RCF selama 5 minit. Sedut supernatan dan larutkan semula pelet dalam 100 μl 1X PBS. Untuk membuang DNA perumah, tambahkan 100 μl penimbal HL-SAN (12.8568 g NaCl, 4 ml 1 M MgCl2, 36 ml air bebas nuklease) dan 10 μl enzim HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Sampel telah dicampurkan dengan teliti melalui pipet dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 minit pada 800 rpm pada Eppendorf™ ThermoMixer C. Selepas pengeraman, disentrifugasi pada 6000 RCF selama 3 minit dan dibasuh dua kali dengan 800 µl dan 1000 µl 1X PBS. Akhir sekali, suspensikan semula pelet dalam 100 µl 1X PBS.
Jumlah DNA bakteria telah diasingkan menggunakan Kit Penulenan DNA Genomik New England Biolabs Monarch (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Prosedur operasi standard yang disediakan bersama kit ini diubah suai sedikit. Inkubasi dan kekalkan air bebas nuklease pada suhu 60°C sebelum operasi untuk elusi akhir. Tambahkan 10 µl Proteinase K dan 3 µl RNase A ke dalam setiap sampel. Kemudian tambahkan 100 µl Penimbal Lisis Sel dan gaul perlahan-lahan. Sampel kemudian diinkubasi dalam Eppendorf™ ThermoMixer C pada suhu 56°C dan 1400 rpm selama sekurang-kurangnya 1 jam dan sehingga 3 jam. Sampel yang diinkubasi disentrifugasi pada 12,000 RCF selama 3 minit dan supernatan daripada setiap sampel dipindahkan ke tiub mikroempar 1.5 mL berasingan yang mengandungi 400 µL larutan pengikat. Tiub tersebut kemudiannya diputar dengan denyutan vorteks selama 5–10 saat pada selang 1 saat. Pindahkan keseluruhan kandungan cecair setiap sampel (kira-kira 600–700 µL) ke dalam kartrij penapis yang diletakkan di dalam tiub pengumpulan aliran-melalui. Tiub-tiub tersebut disentrifugasi pada 1,000 RCF selama 3 minit untuk membolehkan pengikatan DNA awal dan kemudian disentrifugasi pada 12,000 RCF selama 1 minit untuk membuang cecair yang tinggal. Lajur sampel dipindahkan ke tiub pengumpulan baharu dan kemudian dibasuh dua kali. Untuk cucian pertama, tambahkan 500 µL penimbal cucian ke dalam setiap tiub. Terbalikkan tiub 3–5 kali dan kemudian sentrifugasi pada 12,000 RCF selama 1 minit. Buang cecair dari tiub pengumpulan dan letakkan semula kartrij penapis ke dalam tiub pengumpulan yang sama. Untuk cucian kedua, tambahkan 500 µL penimbal cucian ke dalam penapis tanpa menterbalikkan. Sampel disentrifugasi pada 12,000 RCF selama 1 minit. Pindahkan penapis ke dalam tiub LoBind® 1.5 mL dan tambahkan 100 µL air bebas nuklease yang telah dipanaskan terlebih dahulu. Penapis diinkubasi pada suhu bilik selama 1 minit dan kemudian disentrifugasi pada 12,000 RCF selama 1 minit. DNA yang dielusi disimpan pada suhu -80°C.
Kepekatan DNA diukur menggunakan Fluorometer Qubit™ 4.0. DNA disediakan menggunakan Kit Kepekaan Tinggi Qubit™ 1X dsDNA (No. Kategori Q33231) mengikut arahan pengilang. Taburan panjang serpihan DNA diukur menggunakan Aglient™ 4150 atau 4200 TapeStation. DNA disediakan menggunakan Reagen DNA Genomik Agilent™ (No. Kategori 5067-5366) dan ScreenTape DNA Genomik (No. Kategori 5067-5365). Penyediaan perpustakaan dilakukan menggunakan Kit Pengekodan Bar PCR Pantas Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) (SQK-RPB004) mengikut arahan pengilang. DNA dijujukan menggunakan penjujukan ONT GridION™ Mk1 dengan sel aliran Min106D (R 9.4.1). Tetapan penjujukan adalah: panggilan asas ketepatan tinggi, nilai q minimum 9, persediaan kod bar dan pemangkasan kod bar. Sampel telah dijujukan selama 72 jam, selepas itu data panggilan asas dihantar untuk pemprosesan dan analisis selanjutnya.
Pemprosesan bioinformatik telah dijalankan menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini (Greenman et al., 2024). Fail FASTQ yang diperoleh daripada penjujukan telah dibahagikan kepada direktori untuk setiap sampel. Sebelum analisis bioinformatik, data telah diproses menggunakan saluran paip berikut: pertama, fail FASTQ sampel digabungkan menjadi satu fail FASTQ. Kemudian, bacaan yang lebih pendek daripada 1000 bp telah ditapis menggunakan Filtlong v. 0.2.1, dengan satu-satunya parameter yang diubah ialah –min_length 1000 (Wick, 2024). Sebelum penapisan selanjutnya, kualiti bacaan dikawal menggunakan NanoPlot v. 1.41.3 dengan parameter berikut: –fastq –plots dot –N50 -o
Untuk pengelasan taksonomi, bacaan dan kontinjen yang dipasang telah dikelaskan menggunakan Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Jana laporan dan keluarkan fail untuk bacaan dan pemasangan, masing-masing. Gunakan pilihan –use-names untuk menganalisis bacaan dan pemasangan. Pilihan –gzip-compressed dan –paired ditentukan untuk segmen bacaan. Kelimpahan relatif taksa dalam metagenom dianggarkan menggunakan Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Kami mula-mula mencipta pangkalan data kmer yang mengandungi 1000 bes menggunakan bracken-build dengan parameter berikut: -d
Anotasi gen dan anggaran kelimpahan relatif telah dilakukan menggunakan versi protokol yang diubah suai yang diterangkan oleh Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Pertama, kontinjen yang lebih pendek daripada 500 bp telah dialih keluar daripada semua himpunan menggunakan SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Himpunan yang dipilih kemudiannya digabungkan menjadi pan-metagenom. Bingkai bacaan terbuka (ORF) telah dikenal pasti menggunakan Prodigal v. 1.0.1 (versi selari Prodigal v. 2.6.3) dengan parameter berikut: -d
Gen pertama kali dikumpulkan mengikut pengenal ortolog (KO) Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto (KEGG) yang diberikan oleh eggNOG untuk membandingkan kelimpahan laluan gen. Gen tanpa knockout atau gen dengan berbilang knockout telah dialih keluar sebelum analisis. Purata kelimpahan setiap KO setiap sampel kemudiannya dikira dan analisis statistik dilakukan. Gen metabolisme PPA ditakrifkan sebagai mana-mana gen yang diberikan baris ko00640 dalam lajur KEGG_Pathway, yang menunjukkan peranan dalam metabolisme propionat mengikut KEGG. Gen yang dikenal pasti berkaitan dengan pengeluaran PPA disenaraikan dalam Jadual Tambahan 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Ujian permutasi telah dilakukan untuk mengenal pasti gen metabolisme dan pengeluaran PPA yang jauh lebih banyak dalam setiap jenis sampel. Seribu permutasi telah dilakukan untuk setiap gen yang dianalisis. Nilai-p 0.05 telah digunakan sebagai pemotongan untuk menentukan kepentingan statistik. Anotasi fungsi telah diberikan kepada gen individu dalam kelompok berdasarkan anotasi gen perwakilan dalam kelompok. Taksa yang berkaitan dengan metabolisme PPA dan/atau penghasilan PPA boleh dikenal pasti dengan memadankan ID contig dalam fail output Kraken2 dengan ID contig yang sama yang dikekalkan semasa anotasi fungsi menggunakan eggNOG. Ujian keertian dilakukan menggunakan ujian Mann-Whitney U yang diterangkan sebelum ini. Pembetulan untuk ujian berbilang dilakukan menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. Nilai-p ≤ 0.05 digunakan sebagai potongan untuk menentukan keertian statistik.
Kepelbagaian mikrobiom usus tikus dinilai menggunakan indeks kepelbagaian Simpson. Tiada perbezaan ketara yang diperhatikan antara sampel kawalan dan PPA dari segi kepelbagaian genus dan spesies (nilai-p untuk genus: 0.18, nilai-p untuk spesies: 0.16) (Rajah 1). Komposisi mikrob kemudiannya dibandingkan menggunakan analisis komponen utama (PCA). Rajah 2 menunjukkan pengelompokan sampel mengikut filumnya, menunjukkan bahawa terdapat perbezaan dalam komposisi spesies mikrobiom antara sampel PPA dan kawalan. Pengelompokan ini kurang ketara pada peringkat genus, menunjukkan bahawa PPA mempengaruhi bakteria tertentu (Rajah Tambahan 1).
Rajah 1. Kepelbagaian alfa bagi komposisi genera dan spesies mikrobiom usus tikus. Plot kotak menunjukkan indeks kepelbagaian Simpson bagi genera (A) dan spesies (B) dalam sampel PPA dan kawalan. Kepentingan ditentukan menggunakan ujian U Mann-Whitney, dan pembetulan berganda dilakukan menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. ns, nilai-p tidak signifikan (p>0.05).
Rajah 2. Keputusan analisis komponen utama komposisi mikrobiom usus tikus pada peringkat spesies. Plot analisis komponen utama memaparkan taburan sampel merentasi dua komponen utama pertamanya. Warna menunjukkan jenis sampel: Tikus yang terdedah kepada PPA berwarna ungu dan tikus kawalan berwarna kuning. Komponen utama 1 dan 2 diplotkan masing-masing pada paksi-x dan paksi-y, dan dinyatakan sebagai nisbah varians yang dijelaskan.
Menggunakan data kiraan transformasi RLE, penurunan ketara dalam nisbah median Bacteroidetes/Bacilli diperhatikan pada tikus kawalan dan PPA (kawalan: 9.66, PPA: 3.02; nilai-p = 0.0011). Perbezaan ini disebabkan oleh kelimpahan Bacteroidetes yang lebih tinggi dalam tikus PPA berbanding kawalan, walaupun perbezaannya tidak signifikan (min kawalan CLR: 5.51, min PPA CLR: 6.62; nilai-p = 0.054), manakala kelimpahan Bacteroidetes adalah serupa (min kawalan CLR: 7.76, min PPA CLR: 7.60; nilai-p = 0.18).
Analisis kelimpahan ahli taksonomi mikrobiom usus mendedahkan bahawa 1 filum dan 77 spesies berbeza dengan ketara antara sampel PPA dan kawalan (Jadual Tambahan 2). Kelimpahan 59 spesies dalam sampel PPA adalah jauh lebih tinggi daripada sampel kawalan, manakala kelimpahan hanya 16 spesies dalam sampel kawalan adalah lebih tinggi daripada sampel PPA (Rajah 3).
Rajah 3. Perbezaan kelimpahan taksa dalam mikrobiom usus tikus PPA dan kawalan. Plot gunung berapi memaparkan perbezaan dalam kelimpahan genera (A) atau spesies (B) antara sampel PPA dan kawalan. Titik kelabu menunjukkan tiada perbezaan yang ketara dalam kelimpahan taksa. Titik berwarna menunjukkan perbezaan yang ketara dalam kelimpahan (nilai-p ≤ 0.05). 20 taksa teratas dengan perbezaan kelimpahan terbesar antara jenis sampel masing-masing ditunjukkan dalam warna merah dan biru muda (sampel kawalan dan PPA). Titik kuning dan ungu sekurang-kurangnya 2.7 kali lebih banyak dalam sampel kawalan atau PPA berbanding dalam kawalan. Titik hitam mewakili taksa dengan kelimpahan yang berbeza secara signifikan, dengan perbezaan min CLR antara -1 dan 1. Nilai P dikira menggunakan ujian U Mann-Whitney dan dibetulkan untuk ujian berbilang menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. Perbezaan min CLR yang tebal menunjukkan perbezaan yang ketara dalam kelimpahan.
Selepas menganalisis komposisi mikrob usus, kami menjalankan anotasi fungsi mikrobiom. Selepas menapis gen berkualiti rendah, sejumlah 378,355 gen unik telah dikenal pasti merentasi semua sampel. Kelimpahan gen yang diubah suai telah digunakan untuk analisis komponen utama (PCA), dan hasilnya menunjukkan tahap pengelompokan jenis sampel yang tinggi berdasarkan profil fungsinya (Rajah 4).
Rajah 4. Keputusan PCA menggunakan profil fungsian mikrobiom usus tikus. Plot PCA memaparkan taburan sampel merentasi dua komponen utama pertamanya. Warna menunjukkan jenis sampel: tikus yang terdedah kepada PPA berwarna ungu dan tikus kawalan berwarna kuning. Komponen utama 1 dan 2 diplotkan masing-masing pada paksi-x dan paksi-y, dan dinyatakan sebagai nisbah varians yang dijelaskan.
Seterusnya, kami mengkaji kelimpahan knockout KEGG dalam pelbagai jenis sampel. Sebanyak 3648 knockout unik telah dikenal pasti, yang mana 196 daripadanya jauh lebih banyak dalam sampel kawalan dan 106 lebih banyak dalam sampel PPA (Rajah 5). Sebanyak 145 gen dikesan dalam sampel kawalan dan 61 gen dalam sampel PPA, dengan kelimpahan yang berbeza secara signifikan. Laluan yang berkaitan dengan metabolisme lipid dan gula amino jauh lebih diperkaya dalam sampel PPA (Jadual Tambahan 3). Laluan yang berkaitan dengan metabolisme nitrogen dan sistem geganti sulfur jauh lebih diperkaya dalam sampel kawalan (Jadual Tambahan 3). Kelimpahan gen yang berkaitan dengan metabolisme gula amino/nukleotida (ko:K21279) dan metabolisme inositol fosfat (ko:K07291) adalah jauh lebih tinggi dalam sampel PPA (Rajah 5). Sampel kawalan mempunyai lebih banyak gen yang berkaitan dengan metabolisme benzoat (ko:K22270), metabolisme nitrogen (ko:K00368), dan glikolisis/glukoneogenesis (ko:K00131) (Rajah 5).
Rajah 5. Kelimpahan KO yang berbeza dalam mikrobiom usus tikus PPA dan kawalan. Plot gunung berapi menggambarkan perbezaan dalam kelimpahan kumpulan berfungsi (KO). Titik kelabu menunjukkan KO yang kelimpahannya tidak berbeza secara signifikan antara jenis sampel (nilai-p > 0.05). Titik berwarna menunjukkan perbezaan kelimpahan yang signifikan (nilai-p ≤ 0.05). 20 KO dengan perbezaan kelimpahan terbesar antara jenis sampel ditunjukkan dalam warna merah dan biru muda, masing-masing sepadan dengan sampel kawalan dan PPA. Titik kuning dan ungu menunjukkan KO yang sekurang-kurangnya 2.7 kali ganda lebih banyak dalam sampel kawalan dan PPA. Titik hitam menunjukkan KO dengan kelimpahan yang berbeza secara signifikan, dengan perbezaan min CLR antara -1 dan 1. Nilai P dikira menggunakan ujian U Mann-Whitney dan diselaraskan untuk berbilang perbandingan menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. NaN menunjukkan bahawa KO tidak tergolong dalam laluan dalam KEGG. Nilai perbezaan min CLR yang tebal menunjukkan perbezaan kelimpahan yang signifikan. Untuk maklumat terperinci tentang laluan yang dimiliki oleh KO yang disenaraikan, lihat Jadual Tambahan 3.
Antara gen yang diberi anotasi, 1601 gen mempunyai kelimpahan yang berbeza secara signifikan antara jenis sampel (p ≤ 0.05), dengan setiap gen sekurang-kurangnya 2.7 kali ganda lebih banyak. Daripada gen ini, 4 gen lebih banyak dalam sampel kawalan dan 1597 gen lebih banyak dalam sampel PPA. Oleh kerana PPA mempunyai sifat antimikrob, kami mengkaji kelimpahan metabolisme PPA dan gen pengeluaran antara jenis sampel. Antara 1332 gen berkaitan metabolisme PPA, 27 gen jauh lebih banyak dalam sampel kawalan dan 12 gen lebih banyak dalam sampel PPA. Antara 223 gen berkaitan pengeluaran PPA, 1 gen jauh lebih banyak dalam sampel PPA. Rajah 6A selanjutnya menunjukkan kelimpahan gen yang lebih tinggi yang terlibat dalam metabolisme PPA, dengan kelimpahan yang jauh lebih tinggi dalam sampel kawalan dan saiz kesan yang besar, manakala Rajah 6B menonjolkan gen individu dengan kelimpahan yang jauh lebih tinggi diperhatikan dalam sampel PPA.
Rajah 6. Kelimpahan berbeza gen berkaitan PPA dalam mikrobiom usus tikus. Plot gunung berapi menggambarkan perbezaan dalam kelimpahan gen yang berkaitan dengan metabolisme PPA (A) dan penghasilan PPA (B). Titik kelabu menunjukkan gen yang kelimpahannya tidak berbeza secara signifikan antara jenis sampel (nilai-p > 0.05). Titik berwarna menunjukkan perbezaan ketara dalam kelimpahan (nilai-p ≤ 0.05). 20 gen dengan perbezaan terbesar dalam kelimpahan ditunjukkan dalam warna merah dan biru muda (sampel kawalan dan PPA). Kelimpahan titik kuning dan ungu adalah sekurang-kurangnya 2.7 kali lebih besar dalam sampel kawalan dan PPA berbanding sampel kawalan. Titik hitam mewakili gen dengan kelimpahan yang berbeza secara signifikan, dengan perbezaan min CLR antara -1 dan 1. Nilai P dikira menggunakan ujian U Mann-Whitney dan dibetulkan untuk berbilang perbandingan menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. Gen sepadan dengan gen perwakilan dalam katalog gen bukan lewah. Nama gen terdiri daripada simbol KEGG yang menandakan gen KO. Perbezaan min CLR yang tebal menunjukkan kelimpahan yang berbeza secara signifikan. Tanda sempang (-) menunjukkan bahawa tiada simbol untuk gen dalam pangkalan data KEGG.
Taksa dengan gen yang berkaitan dengan metabolisme dan/atau pengeluaran PPA dikenal pasti dengan memadankan identiti taksonomi kontinjen dengan ID kontinjen gen tersebut. Pada peringkat genus, 130 genera didapati mempunyai gen yang berkaitan dengan metabolisme PPA dan 61 genera didapati mempunyai gen yang berkaitan dengan pengeluaran PPA (Jadual Tambahan 4). Walau bagaimanapun, tiada genera menunjukkan perbezaan yang ketara dalam kelimpahan (p > 0.05).
Pada peringkat spesies, 144 spesies bakteria didapati mempunyai gen yang berkaitan dengan metabolisme PPA dan 68 spesies bakteria didapati mempunyai gen yang berkaitan dengan penghasilan PPA (Jadual Tambahan 5). Antara pemetabolisme PPA, lapan bakteria menunjukkan peningkatan ketara dalam kelimpahan antara jenis sampel, dan semuanya menunjukkan perubahan ketara dalam kesannya (Jadual Tambahan 6). Semua pemetabolisme PPA yang dikenal pasti dengan perbezaan ketara dalam kelimpahan adalah lebih banyak dalam sampel PPA. Pengelasan peringkat spesies mendedahkan wakil genera yang tidak berbeza dengan ketara antara jenis sampel, termasuk beberapa spesies Bacteroides dan Ruminococcus, serta Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, dan Alcaligenes polymorpha. Antara bakteria penghasil PPA, empat bakteria menunjukkan perbezaan ketara dalam kelimpahan antara jenis sampel. Spesies dengan perbezaan ketara dalam kelimpahan termasuk Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, dan Ruminococcus bovis.
Dalam kajian ini, kami mengkaji kesan pendedahan PPA terhadap mikrobiota usus tikus. PPA boleh menimbulkan tindak balas yang berbeza dalam bakteria kerana ia dihasilkan oleh spesies tertentu, digunakan sebagai sumber makanan oleh spesies lain, atau mempunyai kesan antimikrob. Oleh itu, penambahannya kepada persekitaran usus melalui suplemen diet mungkin mempunyai kesan yang berbeza bergantung pada toleransi, kerentanan, dan keupayaan untuk menggunakannya sebagai sumber nutrien. Spesies bakteria sensitif boleh dihapuskan dan digantikan oleh spesies yang lebih tahan terhadap PPA atau mampu menggunakannya sebagai sumber makanan, yang membawa kepada perubahan dalam komposisi mikrobiota usus. Keputusan kami mendedahkan perbezaan yang ketara dalam komposisi mikrob tetapi tiada kesan terhadap kepelbagaian mikrob keseluruhan. Kesan terbesar diperhatikan pada peringkat spesies, dengan lebih 70 taksa berbeza dengan ketara dalam kelimpahan antara sampel PPA dan kawalan (Jadual Tambahan 2). Penilaian lanjut terhadap komposisi sampel yang terdedah kepada PPA mendedahkan heterogeniti spesies mikrob yang lebih besar berbanding sampel yang tidak terdedah, menunjukkan bahawa PPA boleh meningkatkan ciri pertumbuhan bakteria dan mengehadkan populasi bakteria yang boleh hidup dalam persekitaran yang kaya dengan PPA. Oleh itu, PPA boleh secara selektif mendorong perubahan dan bukannya menyebabkan gangguan meluas terhadap kepelbagaian mikrobiota usus.
Pengawet makanan seperti PPA sebelum ini telah terbukti dapat mengubah banyaknya komponen mikrobiom usus tanpa menjejaskan kepelbagaian keseluruhan (Nagpal et al., 2021). Di sini, kami memerhatikan perbezaan yang paling ketara antara spesies Bacteroidetes dalam filum Bacteroidetes (dahulunya dikenali sebagai Bacteroidetes), yang diperkaya dengan ketara pada tikus yang terdedah kepada PPA. Peningkatan banyaknya spesies Bacteroides dikaitkan dengan peningkatan degradasi mukus, yang boleh meningkatkan risiko jangkitan dan menggalakkan keradangan (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Satu kajian mendapati bahawa tikus jantan neonatal yang dirawat dengan Bacteroides fragilis menunjukkan tingkah laku sosial yang mengingatkan gangguan spektrum autisme (ASD) (Carmel et al., 2023), dan kajian lain telah menunjukkan bahawa spesies Bacteroides boleh mengubah aktiviti imun dan menyebabkan kardiomiopati radang autoimun (Gil-Cruz et al., 2019). Spesies yang tergolong dalam genera Ruminococcus, Prevotella, dan Parabacteroides juga meningkat dengan ketara pada tikus yang terdedah kepada PPA (Coretti et al., 2018). Spesies Ruminococcus tertentu dikaitkan dengan penyakit seperti penyakit Crohn melalui penghasilan sitokin proinflamasi (Henke et al., 2019), manakala spesies Prevotella seperti Prevotella humani dikaitkan dengan penyakit metabolik seperti hipertensi dan kepekaan insulin (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Akhir sekali, kami mendapati bahawa nisbah Bacteroidetes (dahulunya dikenali sebagai Firmicutes) kepada Bacteroidetes adalah jauh lebih rendah pada tikus yang terdedah kepada PPA berbanding tikus kawalan disebabkan oleh jumlah spesies Bacteroidetes yang lebih tinggi. Nisbah ini sebelum ini telah terbukti sebagai penunjuk penting homeostasis usus, dan gangguan dalam nisbah ini telah dikaitkan dengan pelbagai keadaan penyakit (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), termasuk penyakit radang usus (Stojanov et al., 2020). Secara kolektif, spesies filum Bacteroidetes nampaknya paling terjejas oleh peningkatan PPA diet. Ini mungkin disebabkan oleh toleransi yang lebih tinggi terhadap PPA atau keupayaan untuk menggunakan PPA sebagai sumber tenaga, yang telah terbukti benar untuk sekurang-kurangnya satu spesies, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Secara alternatif, pendedahan PPA ibu boleh meningkatkan perkembangan janin dengan menjadikan usus anak tikus lebih mudah terdedah kepada penjajahan Bacteroidetes; walau bagaimanapun, reka bentuk kajian kami tidak membenarkan penilaian sedemikian.
Penilaian kandungan metagenomik mendedahkan perbezaan yang ketara dalam kelimpahan gen yang berkaitan dengan metabolisme dan penghasilan PPA, dengan tikus yang terdedah kepada PPA mempamerkan kelimpahan gen yang lebih tinggi yang bertanggungjawab untuk penghasilan PPA, manakala tikus yang tidak terdedah kepada PPA mempamerkan kelimpahan gen yang lebih tinggi yang bertanggungjawab untuk metabolisme PAA (Rajah 6). Keputusan ini menunjukkan bahawa kesan PPA terhadap komposisi mikrob mungkin bukan semata-mata disebabkan oleh penggunaannya, jika tidak, kelimpahan gen yang berkaitan dengan metabolisme PPA sepatutnya menunjukkan kelimpahan yang lebih tinggi dalam mikrobiom usus tikus yang terdedah kepada PPA. Satu penjelasannya ialah PPA menjadi perantara kelimpahan bakteria terutamanya melalui kesan antimikrobnya dan bukannya melalui penggunaannya oleh bakteria sebagai nutrien. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa PPA menghalang pertumbuhan Salmonella Typhimurium secara bergantung dos (Jacobson et al., 2018). Pendedahan kepada kepekatan PPA yang lebih tinggi mungkin memilih bakteria yang tahan terhadap sifat antimikrobnya dan mungkin tidak semestinya dapat memetabolismekan atau menghasilkannya. Contohnya, beberapa spesies Parabacteroides menunjukkan kelimpahan yang jauh lebih tinggi dalam sampel PPA, tetapi tiada gen yang berkaitan dengan metabolisme atau penghasilan PPA dikesan (Jadual Tambahan 2, 4, dan 5). Tambahan pula, penghasilan PPA sebagai hasil sampingan penapaian diagihkan secara meluas di kalangan pelbagai bakteria (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Kepelbagaian bakteria yang lebih tinggi mungkin menjadi sebab kepada kelimpahan gen yang lebih tinggi berkaitan dengan metabolisme PPA dalam sampel kawalan (Averina et al., 2020). Tambahan pula, hanya 27 (2.14%) daripada 1332 gen diramalkan sebagai gen yang berkaitan secara eksklusif dengan metabolisme PPA. Banyak gen yang berkaitan dengan metabolisme PPA juga terlibat dalam laluan metabolik lain. Ini seterusnya menunjukkan bahawa kelimpahan gen yang terlibat dalam metabolisme PPA adalah lebih tinggi dalam sampel kawalan; gen ini mungkin berfungsi dalam laluan yang tidak mengakibatkan penggunaan atau pembentukan PPA sebagai hasil sampingan. Dalam kes ini, hanya satu gen yang berkaitan dengan penjanaan PPA menunjukkan perbezaan yang ketara dalam kelimpahan antara jenis sampel. Berbeza dengan gen yang berkaitan dengan metabolisme PPA, gen penanda untuk penghasilan PPA dipilih kerana ia terlibat secara langsung dalam laluan bakteria untuk penghasilan PPA. Dalam tikus yang terdedah kepada PPA, semua spesies didapati mempunyai peningkatan kelimpahan dan kapasiti yang ketara untuk menghasilkan PPA. Ini menyokong ramalan bahawa PPA akan memilih pengeluar PPA dan oleh itu meramalkan bahawa kapasiti pengeluaran PPA akan meningkat. Walau bagaimanapun, kelimpahan gen tidak semestinya berkorelasi dengan ekspresi gen; oleh itu, walaupun kelimpahan gen yang berkaitan dengan metabolisme PPA adalah lebih tinggi dalam sampel kawalan, kadar ekspresi mungkin berbeza (Shi et al., 2014). Untuk mengesahkan hubungan antara kelaziman gen penghasil PPA dan penghasilan PPA, kajian tentang ekspresi gen yang terlibat dalam penghasilan PPA diperlukan.
Anotasi fungsi PPA dan metagenom kawalan mendedahkan beberapa perbezaan. Analisis PCA kandungan gen mendedahkan kelompok diskret antara sampel PPA dan kawalan (Rajah 5). Pengelompokan dalam sampel mendedahkan bahawa kandungan gen kawalan adalah lebih pelbagai, manakala sampel PPA berkumpul bersama. Pengelompokan mengikut kandungan gen adalah setanding dengan pengelompokan mengikut komposisi spesies. Oleh itu, perbezaan dalam kelimpahan laluan adalah konsisten dengan perubahan dalam kelimpahan spesies dan strain tertentu di dalamnya. Dalam sampel PPA, dua laluan dengan kelimpahan yang jauh lebih tinggi berkaitan dengan metabolisme gula amino/nukleotida (ko:K21279) dan pelbagai laluan metabolisme lipid (ko:K00647, ko:K03801; Jadual Tambahan 3). Gen yang berkaitan dengan ko:K21279 diketahui berkaitan dengan genus Bacteroides, salah satu genera dengan bilangan spesies yang jauh lebih tinggi dalam sampel PPA. Enzim ini boleh mengelak tindak balas imun dengan mengekspresikan polisakarida kapsul (Wang et al., 2008). Ini mungkin menjelaskan peningkatan Bacteroidetes yang diperhatikan pada tikus yang terdedah kepada PPA. Ini melengkapi peningkatan sintesis asid lemak yang diperhatikan dalam mikrobiom PPA. Bakteria menggunakan laluan FASIIko:K00647 (fabB) untuk menghasilkan asid lemak, yang mungkin mempengaruhi laluan metabolik perumah (Yao dan Rock, 2015; Johnson et al., 2020), dan perubahan dalam metabolisme lipid mungkin memainkan peranan dalam perkembangan saraf (Yu et al., 2020). Laluan lain yang menunjukkan peningkatan kelimpahan dalam sampel PPA ialah biosintesis hormon steroid (ko:K12343). Terdapat bukti yang semakin meningkat bahawa terdapat hubungan songsang antara keupayaan mikrobiota usus untuk mempengaruhi tahap hormon dan dipengaruhi oleh hormon, sehingga tahap steroid yang tinggi mungkin mempunyai akibat kesihatan hiliran (Tetel et al., 2018).
Kajian ini bukan tanpa batasan dan pertimbangan. Satu perbezaan penting ialah kami tidak menjalankan penilaian fisiologi terhadap haiwan. Oleh itu, tidak mungkin untuk membuat kesimpulan secara langsung sama ada perubahan dalam mikrobiom dikaitkan dengan sebarang penyakit. Satu lagi pertimbangan ialah tikus dalam kajian ini diberi diet yang sama seperti ibu mereka. Kajian masa depan mungkin menentukan sama ada peralihan daripada diet kaya PPA kepada diet bebas PPA meningkatkan kesannya terhadap mikrobiom. Satu batasan kajian kami, seperti kebanyakan kajian lain, ialah saiz sampel yang terhad. Walaupun kesimpulan yang sah boleh dibuat, saiz sampel yang lebih besar akan memberikan kuasa statistik yang lebih besar apabila menganalisis keputusan. Kami juga berhati-hati dalam membuat kesimpulan tentang hubungan antara perubahan dalam mikrobiom usus dan sebarang penyakit (Yap et al., 2021). Faktor-faktor pengganggu termasuk umur, jantina dan diet boleh mempengaruhi komposisi mikroorganisma dengan ketara. Faktor-faktor ini mungkin menjelaskan ketidakkonsistenan yang diperhatikan dalam literatur mengenai hubungan mikrobiom usus dengan penyakit kompleks (Johnson et al., 2019; Lagod dan Naser, 2023). Sebagai contoh, ahli genus Bacteroidetes telah terbukti sama ada meningkat atau menurun dalam haiwan dan manusia dengan ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Begitu juga, kajian komposisi usus pada pesakit dengan penyakit radang usus telah menemui peningkatan dan penurunan dalam taksa yang sama (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Untuk mengehadkan kesan bias jantina, kami cuba memastikan perwakilan jantina yang sama rata supaya perbezaan kemungkinan besar didorong oleh diet. Satu cabaran anotasi berfungsi ialah penyingkiran jujukan gen yang berlebihan. Kaedah pengelompokan gen kami memerlukan identiti jujukan 95% dan persamaan panjang 85%, serta liputan penjajaran 90% untuk menghapuskan pengelompokan palsu. Walau bagaimanapun, dalam beberapa kes, kami memerhatikan COG dengan anotasi yang sama (cth., MUT) (Rajah 6). Kajian lanjut diperlukan untuk menentukan sama ada ortolog ini berbeza, dikaitkan dengan genera tertentu, atau sama ada ini merupakan batasan pendekatan pengelompokan gen. Satu lagi batasan anotasi fungsi ialah potensi salah klasifikasi; gen bakteria mmdA ialah enzim yang diketahui terlibat dalam sintesis propionat, tetapi KEGG tidak mengaitkannya dengan laluan metabolik propionat. Sebaliknya, ortolog scpB dan mmcD adalah berkaitan. Sebilangan besar gen tanpa knockout yang ditetapkan boleh mengakibatkan ketidakupayaan untuk mengenal pasti gen berkaitan PPA semasa menilai kelimpahan gen. Kajian masa depan akan mendapat manfaat daripada analisis metatranskriptom, yang boleh memberikan pemahaman yang lebih mendalam tentang ciri-ciri fungsi mikrobiota usus dan menghubungkan ekspresi gen kepada potensi kesan hiliran. Bagi kajian yang melibatkan gangguan perkembangan saraf tertentu atau penyakit radang usus, penilaian fisiologi dan tingkah laku haiwan diperlukan untuk menghubungkan perubahan dalam komposisi mikrobiom kepada gangguan ini. Kajian tambahan yang memindahkan mikrobiom usus ke dalam tikus bebas kuman juga berguna untuk menentukan sama ada mikrobiom ialah pemacu atau ciri penyakit.
Secara ringkasnya, kami menunjukkan bahawa PPA dalam diet bertindak sebagai faktor dalam mengubah komposisi mikrobiota usus. PPA ialah bahan pengawet yang diluluskan oleh FDA yang terdapat secara meluas dalam pelbagai makanan yang, apabila terdedah dalam jangka masa panjang, boleh menyebabkan gangguan pada flora usus normal. Kami mendapati perubahan dalam kelimpahan beberapa bakteria, menunjukkan bahawa PPA boleh mempengaruhi komposisi mikrobiota usus. Perubahan dalam mikrobiota boleh menyebabkan perubahan dalam tahap laluan metabolik tertentu, yang boleh menyebabkan perubahan fisiologi yang berkaitan dengan kesihatan perumah. Kajian lanjut diperlukan untuk menentukan sama ada kesan PPA dalam diet terhadap komposisi mikrob boleh menyebabkan disbiosis atau penyakit lain. Kajian ini meletakkan asas untuk kajian masa depan tentang bagaimana kesan PPA terhadap komposisi usus boleh memberi kesan kepada kesihatan manusia.
Set data yang dibentangkan dalam kajian ini boleh didapati dalam repositori dalam talian. Nama repositori dan nombor aksesi ialah: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Kajian haiwan ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Florida Tengah (UCF-IACUC) (Nombor Permit Penggunaan Haiwan: PROTO202000002). Kajian ini mematuhi undang-undang, peraturan dan keperluan institusi tempatan.
NG: Pengkonseptualisasian, Pengkurasian data, Analisis formal, Penyiasatan, Metodologi, Perisian, Visualisasi, Penulisan (draf asal), Penulisan (semakan & penyuntingan). LA: Pengkonseptualisasian, Pengkurasian data, Metodologi, Sumber, Penulisan (semakan & penyuntingan). SH: Analisis formal, Perisian, Penulisan (semakan & penyuntingan). SA: Penyiasatan, Penulisan (semakan & penyuntingan). Ketua Hakim: Penyiasatan, Penulisan (semakan & penyuntingan). SN: Pengkonseptualisasian, Pentadbiran projek, Sumber, Penyeliaan, Penulisan (semakan & penyuntingan). TA: Pengkonseptualisasian, Pentadbiran projek, Penyeliaan, Penulisan (semakan & penyuntingan).
Para penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak menerima sebarang sokongan kewangan untuk penyelidikan, kepengarangan, dan/atau penerbitan artikel ini.
Penulis mengisytiharkan bahawa penyelidikan telah dijalankan tanpa sebarang hubungan komersial atau kewangan yang boleh ditafsirkan sebagai potensi konflik kepentingan. Tidak berkenaan.
Semua pendapat yang dinyatakan dalam artikel ini adalah semata-mata daripada penulis dan tidak semestinya mencerminkan pandangan institusi, penerbit, editor atau pengulas mereka. Sebarang produk yang dinilai dalam artikel ini, atau sebarang dakwaan yang dibuat oleh pengeluarnya, tidak dijamin atau disokong oleh penerbit.
Bahan tambahan untuk artikel ini boleh didapati dalam talian: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Asid propionik mendorong gliosis dan neuroinflamasi dengan mengawal selia laluan PTEN/AKT dalam gangguan spektrum autisme. Laporan saintifik 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Analisis statistik data komposisi. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Nisbah Firmicutes/Bacteroidetes sebagai faktor risiko kanser payudara. Jurnal Perubatan Klinikal, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analisis ekspresi pembezaan data kiraan jujukan. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, dkk. (2013). Mikrobiota najis dan metabolit pada kanak-kanak dengan autisme dan gangguan perkembangan berleluasa yang tidak dinyatakan sebaliknya. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Ciri-ciri neurometabolik bakteria mikrobiota usus pada kanak-kanak kecil dengan gangguan spektrum autisme. Jurnal Mikrobiologi Perubatan 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiom sebagai organ manusia. Mikrobiologi Klinikal dan Jangkitan 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Wawasan baharu tentang fisiologi bakteria penghasil asid propionik: Anaerotignum propionicum dan Anaerotignum neopropionicum (dahulunya Clostridium propionicum dan Clostridium neopropionicum). Mikroorganisma 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Pemakanan ibu dan perkembangan janin. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., dan Hochberg, J. (1995). Mengawal kadar positif palsu: Pendekatan praktikal dan cekap untuk ujian berganda. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Masa siaran: 18-Apr-2025