Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau mematikan mod keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Tidak seperti vertebrata, serangga secara meluas dianggap kekurangan hormon steroid seks yang berat sebelah kepada lelaki. Dalam Anopheles gambiae, steroid ekdyson 20-hidroksiekdyson (20E) nampaknya telah berevolusi untuk mengawal perkembangan telur apabila disintesis oleh betina2 dan untuk mendorong tempoh refraktori mengawan apabila dipindahkan secara seksual oleh jantan3. Memandangkan perkembangan telur dan mengawan adalah sifat pembiakan yang penting, memahami bagaimana nyamuk Anopheles betina mengintegrasikan isyarat hormon ini boleh memudahkan reka bentuk program kawalan malaria baharu. Di sini, kami mendedahkan bahawa fungsi pembiakan ini dikawal oleh steroid seks yang berbeza melalui rangkaian enzim pengaktif/penyahaktif ekdysteroid yang kompleks. Kami mengenal pasti ekdyson teroksida khusus lelaki, 3-dehidro-20E (3D20E), yang melindungi keturunan dengan menutup penerimaan seksual wanita selepas pemindahan dan pengaktifan seksual melalui defosforilasi. Terutamanya, pemindahan 3D20E juga mendorong ekspresi gen pembiakan yang mengekalkan perkembangan telur semasa jangkitan Plasmodium, memastikan kesihatan betina yang dijangkiti. 20E yang berasal dari betina tidak menimbulkan seksual tindak balas, tetapi membolehkan individu yang mengawan bertelur selepas kinase perencat 20E dihalang. Pengenalpastian hormon steroid serangga khusus lelaki ini dan peranannya dalam mengawal selia penerimaan seksual wanita, kesuburan dan interaksi dengan Plasmodium menunjukkan potensi untuk mengurangkan kejayaan pembiakan nyamuk yang menyebarkan malaria.
Kes dan kematian malaria meningkat lagi4 disebabkan oleh kerintangan racun serangga yang meluas dalam nyamuk Anopheles, satu-satunya vektor parasit malaria manusia. Biologi perkahwinan nyamuk ini merupakan sasaran yang sangat menarik untuk intervensi kawalan malaria baharu kerana nyamuk betina hanya mengawan sekali5; menjadikan peristiwa perkahwinan tunggal ini steril akan mempunyai potensi besar untuk mengurangkan populasi nyamuk di lapangan.
Wanita menjadi tidak berupaya secara seksual selepas menerima hormon steroid bertiter tinggi daripada lelaki. Kajian telah menunjukkan bahawa pencetus kesukaran untuk mengawan selanjutnya ialah 20-hidroksiekdison (20E), sejenis hormon steroid yang lebih dikenali sebagai pengawal selia kitaran ganti kulit pada peringkat larva. Keupayaan jantan untuk mensintesis dan memindahkan 20E telah berkembang secara khusus dalam spesies Anopheles yang merupakan sebahagian daripada subgenus Cellia7, yang diedarkan di Afrika dan termasuk vektor malaria yang paling berbahaya, termasuk Anopheles gambiae. Ini amat penting kerana dalam spesies ini, betina juga menghasilkan 20E selepas setiap pengambilan darah, dan 20E memacu kitaran oogenesis (lihat ruj. 8). Walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang cara betina mengintegrasikan isyarat daripada dua sumber ekdison yang berbeza (pemindahan jantan dan induksi pengambilan darah) tanpa menjejaskan keupayaan mereka sendiri untuk mengawan. Malah, jika 20E yang dihasilkan oleh betina mencetuskan intoleransi seksual, ini akan menyebabkan ketidaksuburan pada individu yang makan dara, satu tingkah laku yang sangat biasa pada nyamuk ini5.
Satu penjelasan yang mungkin adalah bahawa A. gambiae jantan memindahkan ekdison khusus jantan yang diubah suai, yang mengaktifkan lata isyarat dalam saluran pembiakan betina, mengakibatkan ketidakstabilan mengawan. Walau bagaimanapun, walaupun vertebrata mempunyai pelbagai hormon steroid, seperti estrogen dan androgen (diulas dalam rujukan 9), setahu kami, steroid yang berat sebelah androgenik belum dikenal pasti dalam serangga.
Kami bertekad untuk menentukan repertoir hormon steroid dalam kelenjar aksesori lelaki (MAG) A. gambiae yang matang secara seksual untuk mencari steroid yang mungkin mengubah suai. Menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi yang digandingkan dengan spektrometri jisim tandem (HPLC-MS/MS) dan bukannya kaedah yang kurang spesifik yang digunakan sebelum ini, kami mengesan ekdison (E) dan 20E dalam tisu ini, mengesahkan keputusan sebelumnya. Walau bagaimanapun, sampel didominasi oleh steroid terfosforilasi teroksida, selaras dengan formula 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Rajah 1). Bentuk lain termasuk 3-dehidro-20E (3D20E) dan 20E-22-fosfat (20E22P). Keamatan isyarat HPLC-MS/MS 3D20E22P adalah dua peringkat magnitud lebih tinggi daripada bentuk terdefosforilasinya, 3D20E, dan tiga peringkat magnitud lebih tinggi daripada E dan 20E (Rajah 1). Walaupun di bahagian lain badan dan saluran pembiakan bawah (LRT; Data Lanjutan Rajah 1a). Kami juga menganalisis ekdisteroid pada jantan dan betina yang baru ditutup (<1 hari) dan mengesan 3D20E dan 3D20E22P hanya dalam MAG; E, 20E dan 20E22P terdapat pada kedua-dua jantina (Data Lanjutan Rajah 1b). Data ini menunjukkan bahawa jantan dewasa A. gambiae menghasilkan titer hormon pengubah suai yang tinggi dalam MAG mereka yang tidak disintesis oleh betina.
MAG dan LRT betina (termasuk atrium, vesikel mani, dan parovarium) telah dibedah daripada jantan dara berusia 4 hari (4 hari) dan betina dara dan yang telah dikawinkan (0.5, 3, dan 12 hpm). Ekdison dalam tisu-tisu ini dianalisis dengan HPLC-MS/MS (min ± sem; ujian-t tidak berpasangan, dua belah, kadar penemuan palsu (FDR) dibetulkan; NS, tidak signifikan; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 jam vs. 0.5 jam, P = 0.035; 12 jam vs. 3 jam, P = 0.0015; 12 jam vs. 0.5 jam, P = 0.030. 3D20E22P: 3 jam vs. 0.5 jam, P = 0.25; 12 jam vs. 3 jam, P = 0.0032; 12 jam vs. 0.5 jam, P = 0.015). Data adalah daripada tiga replika biologi. Kawasan puncak bagi setiap ekdison yang diminati telah dikira dan dinormalisasikan dengan bilangan nyamuk. Ekdison diwakili oleh warna seperti berikut: E, hijau; 20E, oren; 20E22P, ungu; 3D20E, biru; 3D20E22P, merah jambu. Sisipan meningkatkan skala pada paksi-y untuk menunjukkan tahap ekdison yang lebih rendah.
Untuk menyiasat sama ada 3D20E22P dan 3D20E dipindahkan semasa mengawan, kami membedah LRT betina pada pelbagai titik masa selepas mengawan. Walaupun ekdison tidak ditemui pada dara, kami memerhatikan sejumlah besar 3D20E22P dalam LRT sejurus selepas mengawan (0.5 jam selepas mengawan, hpm), menurun dari semasa ke semasa, manakala tahap 3D20E meningkat dengan ketara (Rajah 1). Menggunakan 3D20E yang disintesis secara kimia sebagai standard, kami menentukan bahawa tahap hormon steroid ini dalam LRT yang mengawan adalah sekurang-kurangnya 100 kali ganda lebih tinggi daripada 20E (Jadual Data Lanjutan 1). Oleh itu, 3D20E22P ialah ekdison jantan utama yang dipindahkan ke LRT betina semasa mengawan, dan bentuknya yang terdefosforilasi, 3D20E, menjadi sangat banyak sejurus selepas mengawan. Ini menunjukkan peranan penting untuk ekdison yang terakhir dalam biologi selepas mengawan betina.
Selepas menjana set data penjujukan RNA (RNA-seq) baharu (Rajah 2a), menggunakan saluran paip bioinformatik yang dibina khas, kami mencari gen ekdysone kinase (EcK), ekdysone oksidase (EO), dan gen fosfatase yang diubah suai 20E yang diekspresikan dalam tisu pembiakan. Kami mengenal pasti satu gen EPP calon dan dua gen EcK berpotensi (EcK1 dan EcK2), tetapi tidak dapat menemui gen EO calon yang baik. Terutamanya, gen EPP individu diekspresikan pada tahap tinggi (persentil ke-98.9) dalam MAG Gambia tetapi tidak dalam LRT betina (Rajah 2b), bertentangan dengan jangkaan kami kerana defosforilasi 3D20E22P berlaku dalam tisu betina ini. Oleh itu, kami percaya bahawa EPP jantan mungkin dipindahkan semasa mengawan. Malah, kami menggunakan pelabelan isotop stabil in vivo untuk menutup protein betina selepas mengawan, enzim yang dikenal pasti oleh MS dalam atrium betina (Rajah 2c dan Jadual Tambahan 1). Kehadiran EPP dalam MAG dan LRT betina yang dikawinkan (tetapi bukan dara) juga disahkan menggunakan antibodi khusus (Rajah 2d).
a, Saluran paip bioinformatik yang dibina khas untuk mencari gen yang mengekod EcK, EO dan EPP dalam tisu pembiakan setiap jantina. Nombor di sebelah anak panah menunjukkan bilangan calon lelaki dan perempuan pada setiap langkah. Analisis ini mengenal pasti satu gen EPP (EPP) dan satu gen EcK (EcK1) yang diekspresikan dalam lelaki, dan satu gen EcK (EcK2) yang diekspresikan dalam kedua-dua jantina tetapi tidak menghasilkan gen calon EO. b, Peta haba yang membandingkan ekspresi gen calon dalam tisu Anopheles gambiae dan Anopheles albicans yang dara (V) dan mengawan (M). Spca, persenyawaan; MAG, kelenjar aksesori dalam lelaki; bahagian badan yang lain, termasuk payudara, sayap, kaki, badan gemuk, dan organ dalaman dalam kedua-dua jantina, dan ovari pada wanita. EcK2 diekspresikan dengan tinggi dalam MAG dan atria Gambia, manakala EPP hanya terdapat dalam MAG. c, Analisis proteomik translokasi kumpulan ejakulasi lelaki ke dalam atria wanita pada 3, 12 dan 24 hpm, menunjukkan 67 protein paling banyak. Betina dibesarkan dengan diet yang mengandungi 15N untuk melabel (dan menutup) semua protein. Jantan yang tidak ditag dikawinkan dengan betina yang ditag, dan LRT betina dibedah pada 3, 12 dan 24 hpm untuk analisis proteomik (lihat Jadual Tambahan 1 untuk senarai lengkap protein ejakulasi). Sisipan, EPP, Eck1 dan EcK2 dikesan dalam MAG jantan dara melalui analisis proteomik tisu-tisu ini. d, EPP dikesan melalui western blot dalam MAG dan LRT betina yang dikawinkan, tetapi tidak pada betina dara atau jantan atau seluruh badan wanita. Membran secara serentak disiasat dengan antibodi anti-aktin (kawalan pemuatan) dan anti-EPP. Semua lelaki adalah dara. Lihat Rajah Tambahan 1 untuk data sumber gel. Western blots telah dilakukan dua kali dengan hasil yang serupa.
Aktiviti fosfofosfatase ekdisteroid EPP telah disahkan selepas pengeraman oleh HPLC-MS/MS dengan 3D20E22P yang diasingkan daripada MAG (Data Lanjutan Rajah 2a). Tambahan pula, apabila kami mendiamkan EPP melalui gangguan yang dimediasi RNA (RNAi), kami mengesan pengurangan yang ketara dalam aktiviti fosfatase dalam tisu pembiakan jantan ini (Rajah 3a), dan betina yang dikawinkan dengan jantan yang didiamkan EPP menunjukkan kadar 3D20E terdefosforilasi yang lebih rendah (Rajah 3b) walaupun terdapat pendiaman gen separa (Data Lanjutan Rajah 2b,c). Sebaliknya, kami tidak mengesan perubahan ketara dalam nisbah 20E22P/20E dalam nyamuk yang sama, yang mungkin menunjukkan bahawa enzim tersebut khusus untuk 3D20E22P (Rajah 3b).
a, Aktiviti fosfatase yang berkurangan dalam MAG disebabkan oleh pembungkaman EPP menggunakan kawalan EPP RNA untai dua (dsEPP) atau GFP RNA untai dua (dsGFP). Dua puluh kolam MAG digunakan dalam setiap replika (P = 0.0046, ujian-t berpasangan, dua sisi), diwakili oleh titik berasingan. b, Betina yang dikawinkan dengan jantan yang dibungkaman EPP mempunyai kadar 3D20E terdefosforilasi yang jauh lebih rendah pada 3 hpm (P = 0.0043, ujian-t tidak berpasangan, dua sisi), manakala tahap 20E tidak terjejas (P = 0.063, tidak berpasangan). Ujian-t, dua belah). Data dibentangkan sebagai min ± sem daripada tiga kumpulan yang terdiri daripada 13, 16 dan 19 betina setiap satu. c, Betina yang dikawinkan dengan jantan yang disenyapkan EPP mempunyai kadar kawin semula yang jauh lebih tinggi (P = 0.0002, Ujian tepat Fisher, dua belah). Betina mula-mula dipaksa untuk mengawan bagi memastikan status kawin mereka; 2 hari kemudian, mereka telah dihubungi dengan jantan lain yang membawa sperma transgenik untuk menilai kadar pengawinan semula melalui pengesanan PCR kuantitatif transgen.d, betina yang diberi makan darah yang dikawinkan dengan jantan yang disenyapkan EPP mempunyai kesuburan yang berkurangan dengan ketara (P < 0.0001; ujian Mann-Whitney, dua sisi) dan bilangan telur yang sedikit berkurangan (P = 0.088, ujian Mann-Whitney, dua sisi), manakala kadar pemijahan tidak terjejas (P = 0.94, ujian tepat Fisher, dua sisi). Dalam semua panel, n mewakili bilangan sampel nyamuk bebas secara biologi.NS, tidak signifikan.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Seterusnya, kami menilai sama ada defosforilasi ekdison penting untuk mendorong rintangan mengawan pada betina. Terutamanya, betina yang mengawan dengan jantan yang kekurangan EPP mengawan semula pada frekuensi yang jauh lebih tinggi (44.9%) berbanding betina kawalan (10.4%) apabila terdedah kepada jantan (transgenik) tambahan (Rajah 3c). Kami juga memerhatikan penurunan kesuburan yang ketara (Rajah 3d, kiri) dan sedikit penurunan dalam bilangan telur yang diletakkan oleh betina ini (Rajah 3d, tengah), manakala peratusan telur yang diletakkan oleh betina (tindak balas lain yang ditimbulkan pada betina melalui mengawan)) tidak terjejas (Rajah 3d, kanan). Memandangkan kekhususan EPP yang diperhatikan untuk 3D20E22P, keputusan ini menunjukkan bahawa pengaktifan 3D20E oleh EPP yang dipindahkan semasa mengawan mungkin mempunyai peranan penting dalam mematikan penerimaan betina terhadap mengawan selanjutnya, satu tingkah laku yang sebelum ini dikaitkan dengan pemindahan seksual 20E. Oleh itu, hormon khusus lelaki ini juga sangat mempengaruhi kesuburan wanita.
Seterusnya, kami membandingkan aktiviti 20E dan 3D20E dalam eksperimen suntikan pada dara matang secara seksual menggunakan 3D20E yang disintesis secara kimia (Rajah 4a–c) dan 20E yang tersedia secara komersial. Kami mendapati bahawa 3D20E adalah jauh lebih berkesan daripada 20E dalam menutup sensitiviti betina terhadap perkahwinan pada kedua-dua kepekatan (Rajah 4d). Terutamanya, separuh daripada tahap fisiologi 3D20E dalam LRT (1,066 pg selepas suntikan vs. 2,022 pg selepas perkahwinan) mendorong sebahagian besar betina refraktori yang 20 kali ganda lebih tinggi daripada tahap fisiologi 20E (361 pg selepas suntikan) 24 jam selepas suntikan pada kepekatan tertinggi 18 pg selepas perkahwinan; Jadual Data Lanjutan 1). Keputusan ini selaras dengan tanggapan bahawa pemindahan seksual 20E tidak menyebabkan tempoh refraktori mengawan, dan seterusnya menunjukkan 3D20E sebagai faktor utama dalam memastikan hubungan ibu bapa-anak. 3D20E juga jauh lebih aktif daripada 20E dalam ujian bertelur pada betina dara (Rajah 4e), menunjukkan bahawa kadar bertelur normal yang kami perhatikan selepas pembungkaman EPP separa adalah disebabkan oleh kehadiran aktiviti 3D20E sisa yang masih dihasilkan oleh faktor betina yang disebabkan oleh mengawan.
(a,b) 3D20E disintesis secara kimia daripada 20E (a) dengan penukaran/kecekapan yang sangat tinggi (data yang dibentangkan sebagai min ± sem daripada tiga tindak balas sintesis bebas) (b).c, Spektrum jisim (separuh bawah) sepadan dengan ekdison yang terdapat dalam LRT betina yang dikawinkan (separuh atas).d, Berbanding dengan 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Ujian tepat Fisher, dua sisi) dan 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Ujian tepat Fisher, 2 sisi), manakala 20E adalah jauh lebih tinggi daripada kawalan hanya pada dos yang lebih tinggi (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Ujian tepat Fisher, 2 sisi).e, Suntikan 3D20E mendorong kadar pemijahan yang jauh lebih tinggi pada betina dara berbanding kawalan etanol 10% (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Ujian tepat Fisher, dua sisi), manakala 20E berbanding kawalan Hanya pada dos yang lebih tinggi (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Ujian tepat Fisher, dua sisi). 3D20E mendorong kadar pemijahan yang jauh lebih tinggi daripada 20E pada dos yang lebih tinggi (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Ujian tepat Fisher, dua sisi). Dalam semua panel, n mewakili bilangan sampel nyamuk bebas secara biologi. NS, tidak signifikan. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Data adalah daripada tiga replika.
Dalam kajian terdahulu, kami menentukan bahawa pemindahan hormon steroid secara seksual mendorong ekspresi MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), gen pembiakan betina yang melindungi betina A. gambiae daripada jangkitan P. falciparum. Kos kesihatan yang disebabkan oleh 13, parasit malaria manusia yang paling berbahaya. Memandangkan kepentingan MISO kepada kecergasan reproduktif Anopheles di kawasan endemik malaria, kami memutuskan untuk menentukan hormon 3D20E atau 20E yang mencetuskan ekspresi gen ini. Kami mendapati bahawa walaupun suntikan 20E secara khusus atau lebih kuat mendorong beberapa reseptor hormon nuklear (HR), seperti HR3 dan HR4, dan sasaran steroid hiliran biasa, seperti gen yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO lebih kuat didorong oleh 3D20E (Data Lanjutan Rajah 3). Oleh itu, pemindahan seksual hormon steroid androgenik ini nampaknya mendorong mekanisme yang melindungi betina daripada kos yang ditimbulkan oleh jangkitan parasit. Tambahan pula, 3D20E secara berbeza mempengaruhi kedua-dua isoform Reseptor E EcR, mendorong EcR-A dan menindas EcR-B, dan mencetuskan gen pendorong perkahwinan lain dengan lebih kuat, termasuk HPX15, yang mempengaruhi kesuburan wanita. Ini dapat menjelaskan ketidaksuburan yang ketara yang diperhatikan pada wanita yang dikawinkan dengan lelaki yang disenyapkan EPP (Data Lanjutan Rajah 3). Data ini menunjukkan kewujudan laluan hiliran yang diaktifkan secara pilihan oleh dua hormon ekdison yang mungkin mendasari fungsi khusus jantina.
Seterusnya, kami menguji fungsi dua gen EcK yang dikenal pasti dalam saluran bioinformatik kami. Menyenyapkan EcK1 atau EcK2 mengakibatkan kematian yang ketara pada lelaki (Data Lanjutan Rajah 4a), menunjukkan bahawa fosforilasi ekdison, dan dengan itu penyahaktifan, adalah penting untuk kelangsungan hidup. Oleh kerana EcK2 diekspresikan pada tahap yang lebih tinggi daripada EcK1 dan dikesan dalam MAG oleh proteomik (Rajah 2b,c dan Jadual Tambahan 2), kami mengesahkan aktiviti kinase ekdissteroidnya dengan mengeramnya dengan 20E, yang menghasilkan fosforilasi 20E22P (Data Lanjutan Rajah 2).4b). Apabila menggunakan 3D20E sebagai substrat, kami tidak dapat mengesan produk terfosforilasi 3D20E22P (Data Lanjutan Rajah 4c), menunjukkan bahawa 20E dan bukannya 3D20E mungkin merupakan sasaran pilihan EcK2.
Menurut analisis RNA-seq kami, EcK2 juga diekspresikan dengan tinggi dalam LRT betina dara, di mana ia dimatikan selepas mengawan (Rajah 2b). Kami mengesahkan data ini dan menentukan bahawa ekspresi EcK2 tidak terjejas oleh pemberian darah (Data Lanjutan Rajah 5a). Memperluas eksperimen MS awal kami, kami menentukan bahawa puncak 20E22P berkait rapat dengan puncak 20E (22-26 jam selepas pengambilan darah; Data Lanjutan Rajah 5b). Penyenyapan EcK2 pada betina dara mengakibatkan peningkatan 3 kali ganda dalam nisbah relatif 20E kepada 20E22P pada 26 jam selepas pengambilan darah (Data Lanjutan Rajah 2c dan 5c), mengesahkan bahawa EcK2 juga memfosforilasi 20E pada betina. Terutamanya, dara yang kekurangan EcK2 mengekalkan penerimaan seksual penuh (Data Lanjutan Rajah 5d, e), seterusnya menunjukkan bahawa penghasilan 20E betina tidak mendorong tempoh refraktori mengawan. Walau bagaimanapun, betina ini mempunyai kadar bertelur yang meningkat dengan ketara berbanding kawalan, dengan lebih daripada 30% dara bertelur (Data Lanjutan Rajah 5f). Jika suntikan RNA Eck2 beruntai dua (dsEcK2) dilakukan selepas pemberian darah, pemijahan tidak berlaku, dan pada ketika itu puncak 20E akibat pengambilan darah telah menurun. Secara keseluruhan, keputusan ini menyokong model bahawa 20E yang dihasilkan selepas menghisap darah boleh mendorong pemijahan, tetapi hanya apabila blok pemijahan (EcK2 dan mungkin faktor lain) dimatikan oleh pengawinan. Suntikan 20E mahupun 3D20E tidak menghalang ekspresi EcK2 dalam dara (Data Lanjutan Rajah 5g), menunjukkan bahawa faktor lain menjadi perantara perencatan kinase ini. Walau bagaimanapun, tahap 20E selepas pemberian darah tidak mencukupi untuk mendorong ketidakselesaan mengawan, tetapi dicetuskan secara berkesan oleh titer 3D20E yang dipindahkan secara seksual.
Keputusan kami memberikan pandangan penting tentang mekanisme yang mengawal selia kejayaan reproduktif A. gambiae. Satu model telah muncul di mana jantan telah berevolusi untuk mensintesis titer 3D20E yang tinggi, iaitu ekdison yang diubah suai khusus jantan yang menjamin keibubapaan dengan mengurangkan sensitiviti betina terhadap perkahwinan selanjutnya. Pada masa yang sama, vektor malaria ini juga telah mengembangkan sistem yang cekap untuk mengaktifkan 3D20E pada betina sebagai tindak balas kepada pemindahan seksual EPP khusus jantan. Setahu kami, ini adalah contoh pertama sistem hormon steroid yang didominasi jantan dan betina yang melaksanakan fungsi unik dan kritikal dalam serangga. Fungsi ekdison khusus jantan telah dipostulasikan tetapi tidak ditunjukkan secara muktamad. Contohnya, hipotesis yang sebahagian besarnya disangkal 18 ialah fungsi ini mungkin dilakukan oleh prekursor 20E E1. Telah diketahui umum bahawa dalam Drosophila, monandry dicetuskan oleh pemindahan seksual peptida seks kecil 19,20 yang berinteraksi dengan neuron yang mempersarafi saluran pembiakan betina melalui reseptor peptida seks tertentu 21,22. Kerja lebih lanjut diperlukan untuk menentukan isyarat hiliran lata yang dikawal oleh 3D20E dalam A. gambiae betina dan untuk menentukan sama ada lata ini boleh dipelihara antara nyamuk dan Drosophila.
Memandangkan peranan penting 3D20E terhadap kesuburan dan tingkah laku wanita yang dikenal pasti dalam kajian kami, laluan yang membawa kepada sintesis dan pengaktifan 3D20E menawarkan peluang baharu untuk strategi kawalan nyamuk masa hadapan, seperti penjanaan jantan steril yang kompetitif dalam strategi teknologi serangga steril. Gunakan untuk pelepasan liar atau untuk meniru 3D20E dalam permainan dara. Fungsi khusus jantan 3D20E mungkin telah berkembang apabila A. gambiae dan spesies Cellia lain memperoleh keupayaan untuk membekukan air mani mereka ke dalam palam mengawan, kerana ini membolehkan pemindahan sejumlah besar hormon dan enzim pengaktif hormon dengan cekap. Sebaliknya, evolusi 3D20E yang melaksanakan monandry menyediakan mekanisme untuk betina (melalui ekspresi MISO yang tinggi) untuk memihak kepada kecergasan reproduktif mereka di kawasan yang mempunyai prevalens malaria yang tinggi, yang secara tidak langsung menyumbang kepada penularan Plasmodium. Memandangkan 20E betina telah terbukti mempunyai kesan yang mendalam terhadap kemandirian dan pertumbuhan P. falciparum dalam nyamuk Anopheles betina,24 kedua-dua laluan hormon steroid jantan dan betina kini merupakan aspek utama interaksi nyamuk-parasit.
Strain A. gambiae G3 telah diternak di bawah keadaan serangga standard (26-28 °C, kelembapan relatif 65-80%, fotokala terang/gelap 12:12 jam). Larva diberi makan serbuk makanan ikan (Kepingan Tropika TetraMin, Pelet Koi dan Batang Kolam Tetra dalam nisbah 7:7:2). Nyamuk dewasa diberi makan larutan dekstrosa 10% secara ad libitum dan darah manusia setiap minggu (kajian komponen darah). Nyamuk dara diperoleh dengan mengasingkan jantina pada peringkat pupa selepas memeriksa hujungnya melalui mikroskopi. Jantan yang membawa transgen DsRed telah diterangkan sebelum ini.
Eksperimen kawin paksa telah dijalankan mengikut protokol yang diterangkan sebelum ini. Untuk kawin semula jadi, betina dara berusia 4 hari dipelihara dalam nisbah 1:3 dengan jantan dara matang secara seksual selama dua malam. Bagi eksperimen di mana jantan disuntik dengan dsEPP, kandang bersama bertepatan dengan hari ke-3-4 selepas suntikan, apabila aktiviti fosfatase disenyapkan secara maksimum (Data Lanjutan Rajah 2b).
Tisu nyamuk, baki mayat (sebahagian badan), atau seluruh badan dibedah menjadi 100% metanol dan dihomogenkan dengan beader (manik kaca 2 mm, 2,400 rpm, 90 saat). Jumlah tisu dan isipadu metanol adalah seperti berikut: seluruh badan, 50 dalam 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT betina, 25–50 80 µl. Endapan tersebut menjalani pengekstrakan metanol kedua dengan isipadu metanol yang sama. Serpihan sel telah dibuang melalui sentrifugasi. Metanol daripada kedua-dua pengekstrakan digabungkan dan dikeringkan di bawah aliran nitrogen, kemudian digantung semula dalam isipadu 80% metanol dalam air berikut: seluruh badan, 50 µl; MAG dan LRT betina, 30 µl.
Sampel dianalisis pada spektrometer jisim (ID-X, Thermo Fisher) yang digandingkan dengan instrumen LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl sampel disuntik ke dalam lajur 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) yang dikekalkan pada suhu 25 °C. Fasa bergerak untuk LC ialah A (air, 0.1% asid formik) dan B (asetonitril, 0.1% asid formik). Kecerunan LC adalah seperti berikut: 5% B selama 1 minit, kemudian ditingkatkan kepada 100% B selama 11 minit. Selepas 8 minit pada 100%, seimbangkan semula lajur pada 5% B selama 4 minit. Kadar aliran ialah 0.3 ml min-1. Pengionan dalam sumber MS dicapai melalui pengionan elektrosemburan yang dipanaskan dalam mod positif dan negatif.
Spektrometer jisim mengukur data dalam julat m/z dari 350 hingga 680 pada resolusi 60,000 dalam mod MS penuh. Data MS/MS diperoleh pada [M + H]+ (semua sasaran), [M - H2O + H]+ (semua sasaran), dan [M - H]- (sasaran terfosforilasi). Data MS/MS digunakan untuk mengesahkan sifat ekdison sasaran yang mana tiada piawaian tersedia. Untuk mengenal pasti ekdisteroid yang tidak disasarkan, data MS/MS untuk semua puncak HPLC dengan kelimpahan relatif >15% dianalisis. Kuantifikasi menggunakan lengkung piawai yang dicipta daripada piawai tulen (20E, 3D20E) untuk mengira jumlah mutlak atau pencairan satu sampel tertentu (semua sasaran lain) untuk mengira kesetaraannya dengan jumlah yang terdapat dalam seekor jantan. Untuk 3D20E, kuantifikasi dilakukan menggunakan jumlah tambah berikut: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Data telah diekstrak dan diukur menggunakan Tracefinder (versi 4.1). Data MS/MS telah dianalisis menggunakan Xcalibur (versi 4.4). Spektrum MS bagi E, 20E dan 3D20E telah dibandingkan dengan piawaian masing-masing. 3D20E22P telah dianalisis melalui derivatisasi dengan reagen Girard. 20E22P telah dianalisis mengikut nisbah m/z.
3D20E22P telah ditulenkan daripada MAG. Penulenan telah dilakukan pada skala analitikal menggunakan kromatografi cecair berprestasi ultra (Acquity, Waters) dengan pengesan berasaskan jisim kuadrupole (QDa, Acquity, Waters) di bawah keadaan LC yang sama seperti analisis HPLC-MS/MS. Pengumpulan pecahan dicetuskan apabila m/z yang sepadan dengan 3D20E22P dikesan pada masa pengekalan yang sama seperti yang ditentukan sebelum ini. Ketulenan sebatian yang diekstrak kemudiannya diperiksa oleh HPLC-MS/MS seperti yang diterangkan di atas.
RNA total diekstrak daripada 10-12 tisu pembiakan atau bahagian badan yang lain (tanpa kepala) menggunakan reagen TRI (Thermo Fisher) mengikut arahan pengilang. RNA dirawat dengan TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA disintesis menggunakan transkriptase terbalik virus leukemia murine Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) mengikut arahan pengilang. Primer untuk PCR kuantitatif transkripsi terbalik (RT-qPCR; Jadual Data Lanjutan 2) sebelum ini telah diterbitkan24 atau direka bentuk menggunakan Primer-BLAST26, dengan keutamaan diberikan kepada produk bersaiz 70-150 bp dan merangkumi simpang ekson-ekson atau primer pasangan Primer yang memisahkan ekson. Sampel cDNA daripada tiga hingga empat replika biologi dicairkan empat kali ganda dalam air untuk RT-qPCR. Kuantifikasi dilakukan dalam tindak balas replika 15 µl yang mengandungi 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primer dan 5 µl cDNA yang dicairkan. Reaksi dijalankan pada QuantStudio 6 Pro Sistem PCR masa nyata (Thermo Fisher) dan data telah dikumpulkan dan dianalisis menggunakan Reka Bentuk dan Analisis (versi 2.4.3). Seperti yang ditunjukkan dalam kajian ini, jumlah relatif telah dinormalisasikan kepada gen ribosom RpL19 (AGAP004422), yang ekspresinya tidak berubah dengan ketara dengan pemberian darah 27 atau perkahwinan 3.
Kualiti RNA telah diperiksa menggunakan Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Pustaka hujung berpasangan Illumina telah disediakan dan dijalankan di Broad Institute of MIT dan Harvard. Bacaan penjujukan telah diselaraskan dengan genom A. gambiae (strain PEST, versi 4.12) menggunakan HISAT2 (versi 2.0.5) dengan parameter lalai. Bacaan dengan skor kualiti pemetaan (MAPQ) <30 telah dialih keluar menggunakan Samtools (versi 1.3.1). Bilangan bacaan yang dipetakan kepada gen telah dikira menggunakan kiraan htseq (versi 0.9.1) dengan parameter lalai. Kiraan bacaan yang dinormalisasi telah dikira dan ekspresi gen pembezaan dianalisis menggunakan pakej DESeq2 (versi 1.28.1) dalam R (versi 4.0.3).
Calon gen pengubahsuaian Ecdysone telah dikenal pasti dengan mencari genom A. gambiae terlebih dahulu menggunakan algoritma PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), menggunakan nilai lalai Parameter dengan jujukan protein pertanyaan berikut: daripada Bombyx mori (No. Aksesi NP_001038956.1), Musca domestica (No. Aksesi XP_005182020.1, XP_005175332.1 dan XP_011294434.1) dan Microplitis demolitor (No. Aksesi XP_008552646.1 dan XP_008552645.1) EcK daripada B. mori (No. Aksesi NP_001036900), Drosophila melanogaster (No. Aksesi NP_651202), Apis mellifera (No. Aksesi XP_394838) dan Acyrthosiphon pisum (No. Aksesi XP_001947166); dan EPP daripada B. mori (No. Aksesi XP_001947166) NP_001177919.1 dan NP_001243996.1) dan EO bagi D. melanogaster (No. Aksesi NP_572986.1) (langkah 1). Seterusnya, tapis hits berdasarkan ekspresi mRNA yang tinggi (>100 serpihan/kilobase ekson setiap juta bacaan yang dipetakan (FPKM) atau >85%) dalam tisu pembiakan (LRT atau MAG betina) di Gambia (langkah 2). Untuk meningkatkan kekhususan, kami memilih enzim calon yang juga diekspresikan dalam tisu pembiakan A. albimanus, spesies anopheles yang tidak mensintesis atau memindahkan ekdison semasa mengawan. Gen calon ditapis berdasarkan ekspresi rendah (<100 FPKM atau
Betina dara berusia 4-6 hari yang bertanda 15N dipaksa untuk mengawan dengan jantan dara yang tidak bertanda yang sepadan dengan usia. Kejayaan mengawan disahkan dengan mengesan palam mengawan di bawah mikroskopi epifluoresens. Pada 3, 12, dan 24 hpm, atrium 45-55 betina yang dikawinkan dibedah siasat ke dalam 50 µl penimbal ammonium bikarbonat (pH 7.8) dan dihomogenkan dengan alu. Homogenat disentrifugasi dan supernatan dicampurkan dengan 50 µl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) dalam 50 mM ammonium bikarbonat. Supernatan dan pelet daripada setiap sampel dibekukan di atas ais kering dan dihantar semalaman ke makmal MacCoss di Universiti Washington, di mana penyediaan sampel untuk LC-MS/MS telah disiapkan. Suspensi semula pelet dalam 50 µl 0.1% RapiGest dalam 50 mM ammonium bikarbonat dan sonikasi dalam mandian air. Kepekatan protein pelet dan supernatan diukur dengan ujian BCA, sampel dikurangkan dengan 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma), dialkilasi dengan 15 mM iodoacetamide (Sigma) dan diinkubasi pada suhu 37 °C (1:0 50) selama 1 jam dengan nisbah tripsinisasi: tripsin:substrat). RapiGest dilisiskan dengan penambahan 200 mM HCl, diikuti dengan pengeraman pada suhu 37 °C selama 45 minit dan sentrifugasi pada 14,000 rpm selama 10 minit pada suhu 4 °C untuk membuang serpihan. Sampel dibasuh dengan pengekstrakan fasa pepejal dwi-mod (kartrij Oasis MCX, Waters) dan digantung semula dalam 0.1% asid formik untuk kepekatan protein akhir 0.33 µg µl-1. Protein MAG yang tidak dilabel dianalisis secara serupa daripada jantan dara. Dua replika analitik dianalisis untuk setiap sampel. Seterusnya, 1 µg setiap satu dianalisis menggunakan lajur silika terlakur 25-cm 75-μm dengan perangkap frit Kasil1 (PQ) silika terlakur 4-cm yang diisi dengan resin fasa terbalik Jupiter C12 (Phenomenex) dan kromatografi cecair 180 minit. Ringkasan sampel – MS/MS dijalankan pada spektrometer jisim Q-Exactive HF (Thermo Fisher) dengan Sistem nanoACQUITY UPLC (Waters). Data pemerolehan berkaitan data yang dijana untuk setiap larian telah ditukar kepada format mzML menggunakan Proteowizard (versi 3.0.20287) dan menggunakan Comet31 (versi 3.2) terhadap pangkalan data FASTA yang mengandungi jujukan protein daripada Anopheles gambiae (VectorBase versi 54), Anopheles coluzzi. Carian telah dilakukan pada Mali-NIH (VectorBase versi 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Mac 2021), A. gambiae RNA-seq dan terjemahan tiga bingkai bagi bahan cemar manusia yang diketahui. FDR yang dipadankan dengan peta peptida ditentukan menggunakan Percolator32 (versi 3.05) dengan ambang 0.01 dan peptida telah dikumpulkan ke dalam pengenalpastian protein menggunakan parsimoni protein dalam Limelight33 (versi 2.2.0). Kelimpahan protein relatif dianggarkan menggunakan faktor kelimpahan spektrum ternormal (NSAF) yang dikira untuk setiap protein dalam setiap larian seperti yang diterangkan sebelum ini. NSAF relatif kepada setiap protein dirata-ratakan merentasi sampel daripada dua replika biologi yang berbeza. Pelabelan 15N berjaya menutupi proteom betina, walaupun sejumlah kecil protein tidak berlabel dapat dikesan daripada dara berlabel. Kami merekodkan pengesanan pengurangan protein jantan (1-5 spektrum) dalam sampel mentah betina hanya dalam larian teknikal, di mana sampel mentah dijalankan selepas sampel jantan/kawin, hasil daripada "bawaan" HPLC. Protein sekali-sekala yang ditemui sebagai 'bahan pencemar' daripada dara berlabel disenaraikan dalam Jadual Tambahan 1.
Dua peptida antigen, QTTDRVAPAPDQQQ (dalam isotip PA) dan MESDGTTPSGDSEQ (dalam isotip PA dan PB) dalam Genscript. Kedua-dua peptida digabungkan, kemudian dikonjugasikan kepada protein pembawa KLH dan disuntik ke dalam arnab New Zealand. Arnab-arnab tersebut dikorbankan selepas suntikan keempat, dan jumlah IgG diasingkan melalui penulenan afiniti. IgG daripada arnab yang paling khusus EPP digunakan untuk pemblotan barat selanjutnya.
Untuk western blots, MAG (n = 10, di mana n mewakili bilangan sampel nyamuk bebas secara biologi) dan LRT betina (n = 30) daripada jantan dara berusia 4 hari dan betina dara atau yang dikahwinkan secara paksa (<10 selepas mengawan), penimbal pengekstrakan protein (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natrium deoksikolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktel perencat protease (Roche)) telah ditambah secara berasingan. Sampel telah dihomogenkan sejurus selepas pembedahan dengan beader (manik kaca 2 mm, 2,400 rpm, 90 saat). Serpihan yang tidak larut telah dibuang melalui sentrifugasi pada 20,000 g pada suhu 4 °C. Protein telah diukur melalui ujian Bradford (Bio-Rad). Kemudian, 20 µg protein MAG, 40 µg protein LRT, dan 20 µg protein pukal sisa telah didenaturasi dan dipisahkan oleh 10% Bis-Tris NuPAGE menggunakan penimbal MOPS. Protein dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida menggunakan sistem pemindahan iBlot2 (Thermo Fisher). Membran dibasuh dua kali dalam 1× PBS-T (0.1% Tween-20 dalam PBS) dan kemudian disekat dalam penimbal penyekat Odyssey (Li-Cor) selama 1 jam pada suhu 22°C. Membran digoncang semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi primer poliklonal anti-EPP arnab tersuai (1:700 dalam penimbal penyekat) dan antibodi primer monoklonal anti-aktin tikus MAC237 (Abeam; 1:4,000). Membran dibasuh dengan PBS-T dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (anti-arnab keldai 800CW dan anti-tikus kambing 680LT (Li-Cor), kedua-duanya 1:20,000) dalam penimbal penyekat yang mengandungi 0.01% SDS dan 0.2% Tween-20 selama 1 jam pada suhu 22 °C. Membran telah dibasuh dengan PBS-T dan diimejkan dengan pengimbas Odyssey CLx. Imej telah dikumpulkan dan diproses dalam Image Studio (versi 5.2). Jalur khusus yang sepadan dengan isoform EPP-RA (82 kDa) tidak dikesan.
Kawasan pengekodan EPP (sebagai isoform AGAP002463-RB yang mengandungi domain histidin fosfatase, carian domain terpelihara NCBI 34) dan EcK2 (AGAP002181) telah diklon ke dalam plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Primer disenaraikan dalam Jadual Data Lanjutan 2. Lapan penghubung GS4 (secara serentak) dimasukkan sebelum tag 6xHis C-terminal bagi binaan pET-21a(+)-EcK2. Protein rekombinan dihasilkan menggunakan tindak balas sintesis protein E. coli bebas sel NEBExpress (New England BioLabs). Protein rekombinan ditulenkan menggunakan lajur spin NEBExpress Ni (New England BioLabs). Protein kawalan dihidrofolat reduktase (DHFR) dihasilkan menggunakan templat DNA daripada Kit Sintesis Protein E. coli Bebas Sel NEBExpress. Protein disimpan dalam 50% gliserol dalam PBS pada -20 °C sehingga 3 bulan.
Aktiviti fosfatase EPP dan ekstrak tisu diukur menggunakan 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich). Penimbal tindak balas mengandungi 25 mM Tris, 50 mM asid asetik, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, dan 1 mM DTT. Tisu dihomogenkan dalam penimbal tindak balas dan serpihan sel dibuang melalui sentrifugasi. Mulakan tindak balas dengan menambah enzim atau ekstrak tisu kepada penimbal tindak balas yang mengandungi 2.5 mg ml-1 pNPP. Campuran tindak balas diinkubasi pada suhu bilik dalam keadaan gelap, dan jumlah pNP yang ditukar daripada pNPP diukur dengan mengukur penyerapan pada 405 nm pada pelbagai masa.
Untuk aktiviti EcK in vitro, protein diinkubasi dengan 0.2 mg 20E atau 3D20E dalam 200 µl penimbal (pH 7.5) yang mengandungi 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP dan 10 mM MgCl2 selama 2 jam pada suhu 27 °C. Tindak balas dihentikan dengan menambah 800 µl metanol, kemudian disejukkan pada -20 °C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 20,000 g selama 10 minit pada suhu 4 °C. Supernatan kemudiannya dianalisis dengan HPLC-MS/MS. Untuk menyahaktifkan haba protein yang digunakan dalam kumpulan kawalan, protein diinkubasi dalam 50% gliserol dalam PBS selama 20 minit pada suhu 95°C.
Untuk aktiviti EPP in vitro, protein diinkubasi dengan 3D20E22P (bersamaan dengan jumlah yang terdapat dalam 18 pasang MAG, yang ditulenkan oleh HPLC-MS/MS) dalam 100 µl penimbal (pH 7.5) yang mengandungi 25 mM Tris, 50 mM asid asetik, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, dan 1 mM DTT selama 3 jam pada suhu 27 °C. Tindak balas dihentikan dengan menambah 400 µl metanol dan disejukkan pada -20 °C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 20,000 g selama 10 minit pada suhu 4 °C. Supernatan dianalisis oleh HPLC-MS/MS.
Serpihan PCR untuk EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) dan EcK2 (556 bp) telah diamplifikasi daripada cDNA yang disediakan daripada mayat nyamuk tanpa kepala campuran jantina. Serpihan PCR kawalan eGFP (495 bp) telah diamplifikasi daripada pCR2.1-eGFP yang diterangkan sebelum ini; Primer PCR disenaraikan dalam Jadual Data Lanjutan 2. Serpihan PCR dimasukkan di antara promoter T7 terbalik pada plasmid pL4440. Konstruk plasmid diperoleh daripada E. coli kompeten NEB 5-α (New England Biolabs) dan disahkan melalui penjujukan DNA sebelum digunakan (lihat Data Tambahan 1 untuk urutan sisipan). Primer yang dipadankan dengan promoter T7 (Jadual Data Lanjutan 2) digunakan untuk menguatkan sisipan daripada plasmid berasaskan pL4440. Saiz produk PCR disahkan oleh elektroforesis gel agarosa. RNA ds ditranskripsikan daripada templat PCR menggunakan Kit Transkripsi Megascript T7 (Thermo Fisher) dan ditulenkan mengikut arahan pengilang dengan pengubahsuaian yang diterangkan sebelum ini.
Untuk suntikan dsRNA, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) telah disuntik pada kepekatan 10 ng nl-1 ke dalam toraks jantan atau betina dewasa (Nanoject III, Drummond) dalam masa 1 hari selepas eklosi. Tahap penurunan gen ditentukan dalam sekurang-kurangnya tiga replika biologi melalui pengekstrakan RNA, sintesis cDNA dan RT-qPCR. Untuk suntikan ekdyson, betina dara berusia 4 hari atau dara berusia 6 hari yang diberi makan darah telah disuntik dengan 0.13, 0.21, atau 0.63 µg 20E atau 3D20E (Nanoject III, Drummond) pada kepekatan masing-masing 1.3, 2.1, bergantung pada reka bentuk eksperimen atau 6.3 ng nl-1. Suntikan 100 nl 10% (vol/vol) etanol dalam air; 100 nl 3D20E22P dalam 10% etanol (bersamaan dengan 75% daripada jumlah yang terdapat dalam sepasang MAG). Nyamuk telah diagihkan secara rawak kepada kumpulan suntikan.
Untuk ujian pemijahan, nyamuk betina berusia 3 hari diberi makan darah manusia secara ad libitum. Buang nyamuk yang diberi makan separa atau tidak. Bergantung pada rawatan, nyamuk betina diletakkan di dalam cawan pemijahan berasingan selama empat malam sekurang-kurangnya 48 jam selepas pengambilan darah. Telur dikira di bawah stereoskop (Stemi 508, Zeiss); bagi nyamuk betina yang mengawan, telur yang menetas menjadi larva dianggap subur.
Untuk percubaan mengawan, betina dibenarkan sekurang-kurangnya 2 hari bergantung pada rawatan untuk membentuk daya tahan terhadap mengawan, dan jantan jenis liar yang sepadan dengan usia kemudiannya dimasukkan ke dalam sangkar yang sama. Dua malam kemudian, vesikel betina yang disenyawakan dibedah dan DNA genomik dilepaskan melalui pencairan beku dan sonikasi dalam penimbal yang mengandungi 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, dan 25 mM NaCl (pH 8.2). Sampel diinkubasi dengan Proteinase K (0.86 µg µl-1) selama 15 minit pada suhu 55 °C, diikuti oleh 10 minit pada suhu 95 °C. Persediaan DNA genomik mentah dicairkan 10 kali ganda dan tertakluk kepada pengesanan qPCR bagi jujukan kromosom Y; primer disenaraikan dalam Jadual Data Lanjutan 2. Ketiadaan jujukan kromosom Y menunjukkan tiada pengawan.
Untuk ujian kawin semula, betina yang dikawangkan secara paksa telah diperiksa untuk kehadiran palam kawin bagi mengesahkan status kawin dan membenarkan 2 hari untuk membentuk refraktori terhadap kawin tanpa kehadiran jantan, seperti yang diterangkan sebelum ini 36. Jantan yang membawa sperma transgenik DsRed kemudiannya dimasukkan ke dalam sangkar betina. Dua malam kemudian, vesikel yang telah disenyawakan telah dibedah daripada betina, dan DNA genomik telah disediakan seperti yang diterangkan di atas dan tertakluk kepada pengesanan qPCR bagi transgen DsRed; primer disenaraikan dalam Jadual Data Lanjutan 2. Ketiadaan transgen DsRed menunjukkan bahawa tiada kawin semula berlaku.
3D20E telah disintesis seperti yang diterangkan sebelum ini 37. Secara ringkas, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) telah dilarutkan dalam 10 ml air, diikuti dengan penambahan 30 mg platinum hitam (dalam bentuk serbuk, Sigma-Aldrich). Aliran O2 yang lembut telah digelembungkan secara berterusan ke dalam campuran tindak balas, yang dikacau pada suhu bilik. Selepas 6 jam, 30 mL metanol telah ditambah untuk menghentikan tindak balas. Campuran telah disentrifugasi untuk membuang zarah pemangkin. Supernatan telah disejat sehingga kering dalam vakum pada suhu bilik. Produk tindak balas kering telah dilarutkan dalam 10% etanol dan metanol untuk suntikan bagi analisis HPLC-MS/MS. Kadar penukaran (daripada 20E kepada 3D20E) adalah kira-kira 97% (Rajah 4b), dan spektrum MS bagi 3D20E yang disintesis sepadan dengan yang terdapat pada betina yang dikawinkan (Rajah 4c).
Legenda mengandungi butiran khusus ujian statistik yang dijalankan. GraphPad (versi 9.0) telah digunakan untuk melaksanakan ujian tepat Fisher, ujian Mantel-Cox dan ujian-t Student. Ujian Cochran-Mantel-Haenszel telah dijalankan menggunakan skrip R tersuai (tersedia di https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Taburan data telah diuji untuk kenormalan menggunakan ujian Shapiro-Wilk dengan ambang kepentingan 0.05. Apabila data gagal dalam ujian kenormalan, ujian Mann-Whitney telah dijalankan. Data kemandirian telah dianalisis menggunakan ujian Mantel-Cox. Pakej DESeq2 (versi 1.28.1) telah digunakan untuk melaksanakan analisis ekspresi pembezaan peringkat gen RNA-seq. Bar mendatar pada graf mewakili median. Nilai kepentingan P = 0.05 telah digunakan sebagai ambang untuk semua ujian.
Untuk maklumat lanjut tentang reka bentuk kajian, lihat abstrak Laporan Penyelidikan Alam Semula Jadi yang dipautkan ke artikel ini.
Data proteomik MS telah didepositkan ke dalam Konsortium ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) melalui Repositori Rakan Kongsi PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) dengan pengecam set data PXD032157.
Set data RNA-seq disimpan dalam Perpustakaan Komprehensif Ekspresi Gene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) di bawah rekod bersiri GSE198665.
Set data tambahan yang dihasilkan dan/atau dianalisis semasa kajian semasa boleh diperolehi daripada penulis yang berkaitan atas permintaan yang munasabah. Artikel ini menyediakan data sumber.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroid seks serangga yang diabaikan? Jantan: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdison dan perkembangan ovari dalam Anopheles stephens. J. Fisiologi Serangga. 28, 97–109 (1982).
Masa siaran: 8 Julai 2022