Pengisihan protein dalam laluan rembesan adalah penting untuk mengekalkan pengasingan dan homeostasis sel. Selain pengisihan yang dimediasi oleh cangkerang, peranan lipid dalam pengisihan kinesin dalam proses pengangkutan rembesan merupakan persoalan asas yang telah lama wujud dan masih belum dijawab. Di sini, kami menjalankan pengimejan masa nyata resolusi tinggi berbilang warna serentak 3D untuk membuktikan secara in vivo bahawa protein terimobilisasi glikosilfosfatidilinositol yang baru disintesis dengan bahagian lipid seramida yang sangat panjang dikelompokkan dan dikelaskan kepada tapak keluar bersih endoplasma khusus, yang berbeza daripada yang digunakan oleh protein transmembran. Di samping itu, kami menunjukkan bahawa panjang rantai seramida dalam membran retikulum endoplasma adalah penting untuk selektiviti pengisihan ini. Kajian kami menyediakan bukti in vivo langsung pertama untuk mengklasifikasikan kargo protein berdasarkan panjang rantai lipid ke dalam tapak eksport terpilih dalam laluan rembesan.
Dalam sel eukariotik, protein yang disintesis dalam retikulum endoplasma (ER) kemudiannya disusun semasa pengangkutan melalui laluan rembesan untuk penghantaran ke destinasi selular yang sesuai (1). Selain penyusunan yang dimediasi lapisan, telah lama dispekulasikan bahawa lipid tertentu juga boleh berfungsi sebagai titik keluar terpilih dengan mengelompokkannya ke dalam domain membran tertentu yang protein tertentu (2-5). Walau bagaimanapun, masih terdapat kekurangan bukti langsung in vivo untuk membuktikan mekanisme berasaskan lipid yang mungkin ini. Untuk menyelesaikan masalah asas ini, kami mengkaji dalam yis bagaimana protein berlabuh glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) dieksport secara berbeza dari ER. GPI-AP adalah pelbagai protein permukaan sel yang berkaitan dengan lipid (6, 7). GPI-AP adalah protein yang dirembeskan yang melekat pada risalah luar membran plasma melalui bahagian glikolipid (sauh GPI). Mereka menerima sauh GPI sebagai pengubahsuaian pasca-translasi konservatif dalam lumen ER (8). Selepas melekat, GPI-AP melalui radas Golgi (5, 9) dari ER ke membran plasma. Kehadiran sauh GPI menyebabkan GPI-AP diangkut secara berasingan daripada protein yang dirembeskan transmembran (termasuk protein membran plasma lain) di sepanjang laluan rembesan (5, 9, 10). Dalam sel yis, GPI-AP dipisahkan daripada protein lain yang dirembeskan dalam retikulum endoplasma, dan kemudian dibungkus ke dalam vesikel unik yang dibalut oleh kompleks protein salutan II (COPII) (6, 7). Penentu proses pengelasan ini dalam proses eksport ER tidak jelas, tetapi dispekulasikan bahawa mekanisme ini mungkin memerlukan lipid, terutamanya pembentukan semula struktur bahagian lipid sauh GPI (5, 8). Dalam yis, pembentukan semula lipid GPI bermula sejurus selepas GPI melekat, dan dalam banyak kes, ia menyebabkan seramida terikat pada asid lemak tepu rantai panjang 26-karbon (C26:0) (11, 12). Seramida C26 merupakan seramida utama yang dihasilkan oleh sel yis setakat ini. Ia disintesis dalam ER dan kebanyakannya dieksport ke radas Golgi melalui vesikel COPII (13). Eksport ER GPI-AP secara khusus memerlukan sintesis seramida yang berterusan (14, 15), dan seterusnya, penukaran seramida kepada seramida inositol fosfat (IPC) dalam radas Golgi bergantung pada sintesis sauh GPI (16). Kajian biofizikal dengan membran buatan telah menunjukkan bahawa seramida rantai asil yang sangat panjang boleh bergabung untuk membentuk domain tertib dengan sifat fizikal yang unik (17, 18). Data ini membawa kepada hipotesis bahawa seramida C26 dan GPI-AP dengan seramida C26 menggunakan sifat fizikal mereka untuk bergabung menjadi kawasan atau kawasan yang teratur dalam persekitaran lipid membran ER yang agak tidak kemas. Ia terutamanya terdiri daripada gliserolipid pendek dan tak tepu (C16:1 dan C18:1) (19, 20). Kawasan-kawasan ini akan difokuskan secara selektif pada tapak keluar ER (ERES) tertentu, di mana seramida dan GPI-AP berasaskan seramida boleh diangkut bersama ke Golgi dalam vesikel COPII khusus yang sama (5).
Dalam kajian ini, kami telah menguji secara langsung mekanisme berasaskan lipid ini dengan menggunakan mikroskopi pengimejan masa nyata confocal resolusi super (SCLIM), iaitu teknik mikroskopi canggih yang boleh memerhatikan protein berlabel fluoresen secara serentak. Imej tiga warna dan tiga dimensi (3D) mempunyai resolusi dan kelajuan yang sangat tinggi dalam sel hidup (21, 22).
Kami mula-mula menggunakan teknologi SCLIM untuk menentukan dengan lebih lanjut bagaimana GPI-AP normal dengan kumpulan seramida C26 ditapis daripada protein yang dirembeskan transmembran selepas meninggalkan ER dalam S. cerevisiae. Untuk menyemak pengelasan ER, kami menggunakan sistem genetik yang boleh menggambarkan secara langsung kargo yang baru disintesis memasuki ERES secara in vivo (7, 23). Sebagai kargo, kami memilih Gas1 GPI-AP berasaskan seramida C26 yang dilabelkan dengan protein pendarfluor hijau (GFP) dan protein yang dirembeskan transmembran Mid2 yang dilabelkan dengan protein pendarfluor inframerah dekat (iRFP), kedua-duanya menyasarkan membran plasma (24–26). Dalam mutan sensitif suhu sec31-1, kedua-dua kargo ini diekspresikan di bawah promoter yang boleh diinduksi galaktosa dan penanda ERES konstitutif. Pada suhu yang melampau (37°C), kerana mutasi sec31-1 mempengaruhi fungsi komponen salutan COPII Sec31 untuk menghalang percambahan COPII dan eksport ER, kargo yang baru disintesis terkumpul di ER (23). Selepas disejukkan pada suhu rendah (24°C), sel-sel mutan sec31-1 pulih daripada kawasan rembesan, dan kargo sintetik baharu yang terkumpul mula dieksport dari ER. Visualisasi CLIM menunjukkan bahawa kebanyakan Gas1-GFP dan Mid2-iRFP yang baru disintesis masih terkumpul dalam ER sel mutan sec31-1 selepas pengeraman pada suhu 37°C dan kemudian dilepaskan pada suhu 24°C selama 5 minit (Rajah 1). Oleh kerana Mid2-iRFP diedarkan pada keseluruhan membran ER, dan Gas1-GFP tertumpu dan terkumpul di kawasan membran ER yang tidak berterusan, taburannya adalah sama sekali berbeza (Rajah 1, A hingga C dan Filem S1). Di samping itu, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1D, gugusan Gas1-GFP tidak mempunyai Mid2-iRFP. Keputusan ini menunjukkan bahawa GPI-AP dan protein transmembran telah dipisahkan kepada kawasan membran ER yang berbeza lebih awal. Gugusan Gas1-GFP bersebelahan dengan ERES tertentu yang dilabelkan dengan protein salutan COPII mCherry Sec13 (Rajah 1, E dan F, dan filem S1) (23).
Sel sec31-1 mengekspresikan rembesan yang disebabkan oleh galaktosa, seramida rantai asil panjang (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES Konstruktif Sec13-mCherry (ERES, magenta) ini diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 minit, dipindahkan ke 24°C, dan diimejkan oleh SCLIM 5 minit kemudian. (A hingga C) menunjukkan imej 2D gabungan atau tunggal yang mewakili satah (A), imej unjuran 2D bagi 10 bahagian-z (B) atau imej hemisfera sel 3D bagi penanda kargo dan ERES (C). Bar skala 1μm (A dan B). Unit skala ialah 0.551μm (C). Gas1-GFP dikesan dalam kawasan atau kelompok ER diskret, manakala Mid2-iRFP dikesan dan diedarkan ke seluruh membran ER (C). (D) Graf menunjukkan keamatan pendarfluor relatif Gas1-GFP dan Mid2-iRFP dalam gugusan Gas1-GFP di sepanjang garis anak panah putih (kiri). AU, unit sembarangan. (E dan F) mewakili imej 3D yang menggabungkan tanda barangan dan ERES. Gugusan Gas1-GFP dikesan berhampiran ERES tertentu. Unit skala ialah 0.551μm. (F) Anak panah pepejal putih menandakan gugusan Gas1-GFP yang dikaitkan dengan ERES. Panel tengah dan kanan menunjukkan imej 3D yang dibesarkan dan gabungan serta pandangan berputar bagi gugusan Gas1-GFP yang dipilih.
Hubungan ruang yang rapat antara kluster Gas1-GFP dan ERES tertentu menunjukkan bahawa Gas1-GFP boleh memasuki ERES terpilih, yang berbeza daripada selektiviti yang digunakan oleh Mid2-iRFP untuk meninggalkan ER. Untuk menangani kemungkinan ini, kami mengukur nisbah ERES untuk hanya satu atau dua barang (Rajah 2, A hingga C). Kami mendapati bahawa kebanyakan ERES (70%) hanya mengandungi satu jenis kargo. Imej bawah Rajah 2C menunjukkan dua contoh tipikal ERES dengan hanya Gas1-GFP (Rajah 1) atau hanya Mid2-iRFP (Rajah 2). Sebaliknya, kira-kira 20% daripada ERES mengandungi dua kargo yang bertindih di kawasan yang sama. Didapati bahawa sesetengah ERES (10%) mengandungi dua jenis kargo, tetapi ia diasingkan di kawasan yang jelas berbeza. Oleh itu, analisis statistik ini menunjukkan bahawa selepas ER dieksport, GPI-AP Gas1-GFP dan kargo transmembran Mid2-iRFP dibahagikan kepada ERES yang berbeza (Rajah 2D). Kecekapan pengisihan ini sangat konsisten dengan analisis biokimia (6) dan penentuan morfologi (7) sebelumnya. Kita juga boleh memerhatikan tingkah laku kargo yang dikuarantin memasuki ERES (Rajah 2E dan Filem S2). Rajah 2E menunjukkan bahawa hanya sebahagian kecil Gas1-GFP (panel 3) atau Mid2-iRFP (panel 4) memasuki ERES dari satu sisi dan terkurung di kawasan diskret. Panel 5 Rajah 2E menunjukkan bahawa Gas1-GFP dan Mid2-iRFP kadangkala ditemui dalam ERES yang sama, tetapi ia masuk dari sisi yang berbeza dan tertumpu di kawasan berasingan yang mungkin mewakili vesikel COPII yang berbeza. Kami juga mengesahkan bahawa pemisahan dan pengelasan Gas1 berasaskan seramida C26 GPI-AP sebagai ERES terpilih yang diperhatikan adalah khusus kerana kargo rembesan transmembran yang lain, protein membran plasma bertanda GFP Axl2 (27), menunjukkan tingkah laku yang serupa dengan Mid2-iRFP. (Gambar S1 dan Filem S3). Axl2-GFP yang baru disintesis diedarkan melalui membran ER seperti Mid2-iRFP (Rajah S1, A dan B), dan disetempatkan bersama dengan Mid2-iRFP dalam kebanyakan ERES (Rajah S1, B hingga D). Panel 1 dan 2 Rajah 1. S1C menunjukkan dua contoh tipikal ERES di mana dua kargo transmembran bertindih. Dalam kes ini, kedua-dua barang memasuki ERES bersama-sama (Rajah S1E, Panel 3 dan Filem S3).
Sel sec31-1 yang mengekspresikan rembesan boleh teraruh galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) diletakkan pada suhu 37°C. Selepas pengeraman selama 30 minit pada suhu °C, pindahkan ke 24°C untuk melepaskan blok rembesan, dan imej dengan SCLIM selepas 20 minit. (A hingga C) Imej unjuran 2D perwakilan (A; bar skala, 1μm) atau imej hemisfera sel 3D (B dan C; unit skala, 0.456μm) kargo dan 10 bahagian-z yang ditanda dengan ERES. Panel bawah dalam (B) dan panel dalam (C) memaparkan imej yang diproses untuk memaparkan hanya barang yang terdapat dalam ERES (magenta) [Gas1-GFP (kelabu) dan Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Anak panah terbuka: ERES hanya membawa sekeping kargo (1 hingga 4). Anak panah kelabu: ERES mengandungi kargo terasing (5). Anak panah putih pepejal: ERES mengandungi kargo yang terletak bersama. Di bawah: ERES tunggal yang dipilih hanya mengandungi Gas1-GFP (1) atau Mid2-iRFP (2). Bar skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf yang diterangkan dalam (C). Peratusan purata ERES yang hanya mengandungi satu kargo (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP), kargo terasing dan kargo bertindih. Dalam tiga eksperimen bebas, n=432 dalam 54 sel. Bar ralat = SD. Ujian t dua hujung tidak berpasangan. *** P = 0.0002. (E) Imej 3D ERES terpilih bagi kargo yang dikuarantin yang ditanda dengan (C). Gas1-GFP (hijau) (3) atau Mid2-iRFP (biru) (4) memasuki ERES (magenta) dari satu sisi dan terhad kepada kawasan kecil dalam ERES. Kadangkala, kedua-dua jenis kargo memasuki ERES (5) yang sama dari sisi yang sama dan terhad kepada kawasan terpencil di dalam ERES. Bar skala, 100 nm.
Seterusnya, kami menguji hipotesis bahawa seramida rantai asil panjang (C26) yang terdapat dalam membran ER memacu pengelompokan dan pengisihan khusus Gas1 ke dalam ERES terpilih. Untuk tujuan ini, kami menggunakan strain yis yang diubah suai GhLag1, di mana dua sintase seramida endogen Lag1 dan Lac1 digantikan oleh GhLag1 (homolog kapas Lag1), menghasilkan strain yis dengan membran sel strain Seramida yang lebih pendek daripada jenis liar (Rajah 3A) (28). Analisis spektrometri jisim (MS) menunjukkan bahawa dalam strain jenis liar, 95% daripada jumlah seramida adalah seramida rantai sangat panjang (C26), manakala dalam GhLag1, 85% daripada seramida adalah sangat panjang (C18 dan C16). ), hanya 2% daripada seramida adalah seramida rantai sangat panjang (C26). Walaupun seramida C18 dan C16 merupakan seramida utama yang dikesan dalam membran GhLag1 setakat ini, analisis MS juga mengesahkan bahawa sauh GPI Gas1-GFP yang diekspresikan dalam strain GhLag1 mengandungi seramida C26, yang setanding dengan lipid jenis liar. Kualitinya adalah sama (Rajah 3A) (26). Oleh itu, ini bermakna enzim pembentukan semula seramida Cwh43 sangat selektif untuk seramida C26, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 26, ia secara pilihan menggabungkan sauh GPI daripada sejumlah kecil seramida C26 dalam strain GhLag1. S2 (29). Walau bagaimanapun, membran sel GhLag1 pada asasnya hanya mengandungi seramida C18-C16, manakala Gas1-GFP masih mempunyai seramida C26. Fakta ini menjadikan strain ini alat yang ideal untuk menyelesaikan masalah panjang rantai asil seramida membran dalam ER. Peranan hipotetikal kelas dan pengisihan. Kemudian, kami mula-mula mengkaji keupayaan C26 Gas1-GFP untuk terkumpul dalam kelompok dalam GhLag1 dengan alel mutan sensitif suhu sec31-1 melalui mikroskopi pendarfluor konvensional, di mana hanya rantai panjang (C18-C16) wujud dalam membran ER Ceramide (Rajah 3). Kami memerhatikan bahawa dalam sec31-1, kebanyakan Gas1-GFP tertumpu dalam kelompok, manakala Gas1-GFP dalam sec31-1 GhLag1 dengan membran ER ceramide panjang (C18-C16) kebanyakannya tidak berkelompok dan tersebar di seluruh membran ER. Untuk lebih tepat, kerana pengelompokan berasaskan ceramide C26 berkait rapat dengan ERES tertentu (Rajah 1), kami seterusnya menyiasat sama ada proses ini juga mungkin melibatkan fungsi mekanisme protein eksport ER. GPI-AP menggunakan sistem COPII khas untuk eksport ER, yang dikawal selia secara aktif oleh pembentukan semula struktur Ted1 pada bahagian glikan sauh GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan kemudiannya dikenali oleh kompleks reseptor kargo transmembran p24, yang seterusnya merekrut Lst1 secara selektif, iaitu isoform khusus bagi subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, membentuk Vesikel COPII yang kaya dengan GPI-AP (31-33). Oleh itu, kami membina mutan berganda yang menggabungkan penghapusan protein tunggal ini (komponen kompleks p24 Emp24, enzim pengubahsuaian GPI-glikan Ted1 dan subunit COPII khusus Lst1) dengan strain mutan sec31-1, dan mengkajinya. Adakah mungkin untuk membentuk kluster Gas1 GFP (Rajah 3). Kami memerhatikan bahawa dalam sec31-1emp24Δ dan sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP terutamanya tidak berkelompok dan diedarkan di seluruh membran ER, seperti yang dilihat sebelum ini dalam sec31-1 GhLag1, manakala dalam sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Seperti sec31-1. Keputusan ini menunjukkan bahawa selain kehadiran seramida C26 dalam membran ER, pengelompokan Gas1-GFP juga perlu mengikat pada kompleks p24, dan tidak memerlukan perekrutan Lst1 khusus. Kemudian, kami meneroka kemungkinan bahawa panjang rantai seramida dalam membran ER dapat mengatur pengikatan Gas1-GFP pada p24. Namun, kami mendapati bahawa kehadiran seramida C18-C16 dalam membran tidak mempengaruhi GPI-glikan yang dibina semula oleh kompleks p24 (Rajah S3 dan S4, A dan B) atau pengikatan pada GPI-AP dan kemampuan mengeksport GPI-AP. Merekrut subjenis COPII Lst1 (Rajah S4C). Oleh itu, pengelompokan yang bergantung pada seramida C26 tidak memerlukan interaksi protein dengan mekanisme pengeksportan protein ER yang berbeza, tetapi menyokong mekanisme pengisihan alternatif yang didorong oleh panjang lipid. Kemudian, kami menganalisis sama ada panjang rantai seramida asil dalam membran ER adalah penting untuk pengelasan Gas1-GFP yang berkesan sebagai ERES selektif. Oleh kerana Gas1 dalam strain GhLag1 dengan seramida rantai pendek meninggalkan ER dan memasuki membran plasma (Rajah S5), kami percaya bahawa jika pengisihan didorong oleh panjang rantai asil seramida, Gas1 dalam strain GhLag1 boleh dialihkan dan disilang. ERES dihasilkan dengan membran yang sama.
(A) Membran sel GhLag1 terutamanya mengandungi seramida C18-C16 yang lebih pendek, manakala sauh GPI Gas1-GFP masih mempunyai IPC C26 yang sama seperti sel jenis liar. Atas: analisis panjang rantai asil seramida dalam membran sel strain jenis liar (Wt) dan GhLag1p melalui spektrometri jisim (MS). Data mewakili peratusan jumlah seramida. Purata tiga eksperimen bebas. Bar ralat = SD. Ujian t dua hujung tidak berpasangan. **** P <0.0001. Panel bawah: Analisis MS panjang rantai asil IPC yang terdapat dalam sauh GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) yang dinyatakan dalam strain jenis liar dan GhLag1p. Data mewakili peratusan jumlah isyarat IPC. Purata lima eksperimen bebas. Bar ralat = SD. Ujian t dua hujung tidak berpasangan. ns, tidak penting. P = 0.9134. (B) Mikrograf pendarfluor sel sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ dan sec31-1lst1Δ yang mengekspresikan Gas1-GFP yang teraruh galaktosa diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 minit dan diturunkan untuk Melakukan mikroskopi pendarfluor rutin selepas 24°C. Anak panah putih: Gugusan ER Gas1-GFP. Anak panah terbuka: Gas1-GFP yang tidak berkelompok diedarkan pada keseluruhan membran ER, menunjukkan pewarnaan cincin nuklear ciri ER. Bar skala, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf yang diterangkan dalam (B). Peratusan purata sel dengan struktur Gas1-GFP yang berbintik-bintik. Dalam tiga eksperimen bebas, n≥300 sel. Bar ralat = SD. Ujian-t tidak berpasangan dua hujung. **** P <0.0001.
Untuk menyelesaikan masalah ini secara langsung, kami melakukan visualisasi SCLIM Gas1-GFP dan Mid2-iRFP dalam GhLag1 dengan alel mutan sensitif suhu sec31-1 (Rajah 4 dan Filem S4). Selepas ER dikekalkan pada suhu 37°C dan seterusnya dilepaskan pada suhu 24°C, kebanyakan Gas1-GFP yang baru disintesis tidak dikelompokkan dan diedarkan ke seluruh membran ER, seperti yang diperhatikan oleh mikroskop konvensional (Rajah 4, A dan B). Di samping itu, peratusan besar ERES (67%) merangkumi dua jenis kargo yang terletak bersama di dalamnya (Rajah 4D). Panel 1 dan 2 Rajah 4C menunjukkan dua contoh tipikal ERES dengan Gas1-GFP dan Mid2-GFP yang bertindih. Di samping itu, kedua-dua barangan direkrut ke dalam ERES yang sama (Rajah 4E, panel 3 dan filem S4). Oleh itu, keputusan kami menunjukkan bahawa panjang rantai seramida asil dalam membran ER adalah penentu penting pengagregatan dan pengelasan protein ER.
Sel Sec31-1 GhLag1 yang mengekspresikan rembesan teraruh galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan Mid2-iRFP (TMP, biru) dan Sec13-mCherry berlabel ERES konstitutif (ERES, magenta) Inkubasi pada suhu 37°C. Teruskan selama 30 minit, turunkan kepada 24°C untuk melepaskan rembesan, dan imej dengan SCLIM selepas 20 minit. (A hingga C) Imej unjuran 2D perwakilan (A; bar skala, 1μm) atau imej hemisfera sel 3D (B dan C; unit skala, 0.45μm) bagi 10 bahagian-z yang ditanda dengan kargo dan ERES. Panel bawah dalam (B) dan panel dalam (C) memaparkan imej yang diproses untuk hanya memaparkan barang yang terdapat dalam ERES (magenta) [Gas1-GFP (kelabu) dan Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Anak panah berisi putih: ERES, barang bertindih. Anak panah terbuka: ERES hanya mengandungi satu item. Panel bawah: ERES yang dipilih mempunyai barang bertindih (1 dan 2) yang ditanda dalam (C). Bar skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf yang diterangkan dalam (C). Dalam unit sec31-1 dan sec31-1 GhLag1, hanya satu kargo (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP) dimasukkan, dan peratusan purata ERES untuk kargo terpencil dan kargo bertindih. Dalam tiga eksperimen bebas, n = 432 dalam 54 sel (sec31-1) dan n = 430 dalam 47 sel (sec31-1 GhLag1). Bar ralat = SD. Ujian t dua hujung tidak berpasangan. *** P = 0.0002 (sec31-1) dan ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imej 3D ERES yang dipilih dengan kargo bertindih (3) yang ditanda dalam (C). Gas1-GFP (hijau) dan Mid2-iRFP (biru) menghampiri ERES (magenta) dari sisi yang sama dan kekal di kawasan terhad ERES yang sama. Bar skala, 100 nm.
Kajian ini memberikan bukti langsung in vivo bahawa kargo protein berasaskan lipid dikelaskan kepada tapak eksport terpilih dalam laluan rembesan, dan mendedahkan kepentingan panjang rantai asil untuk selektiviti pengelasan. Menggunakan teknik mikroskopi yang berkuasa dan canggih yang dipanggil SCLIM, kami menunjukkan Gas1-GFP yang baru disintesis (membran plasma utama GPI-AP dengan bahagian lipid seramida rantai asil (C26) yang sangat panjang) dalam yis) Kawasan yang berkelompok dalam ER diskret dikaitkan dengan ERES tertentu, manakala protein yang dirembeskan transmembran diedarkan ke seluruh membran ER (Rajah 1). Di samping itu, kedua-dua jenis barang ini memasuki ERES yang berbeza secara selektif (Rajah 2). Panjang rantai asil seramida selular dalam membran dikurangkan daripada C26 kepada C18-C16, gugusan Gas1-GFP terganggu ke dalam kawasan ER diskret, dan Gas1-GFP dialihkan untuk meninggalkan ER dengan protein transmembran melalui ERES yang sama (Rajah 3 dan Rajah 3). 4).
Walaupun GPI-AP menggunakan mekanisme protein khusus untuk keluar dari ER, kami mendapati bahawa pemisahan yang bergantung kepada seramida C26 tidak bergantung pada interaksi protein berbeza yang boleh membawa kepada pengkhususan ERES (Rajah S4 dan S5). Sebaliknya, penemuan kami menyokong mekanisme pengelasan alternatif yang didorong oleh pengelompokan protein berasaskan lipid dan pengecualian kargo lain seterusnya. Pemerhatian kami menunjukkan bahawa rantau atau kelompok Gas1-GFP yang berkaitan dengan ERES tertentu kekurangan protein yang dirembeskan transmembran Mid2-iRFP, yang menunjukkan bahawa kelompok GPI-AP yang bergantung kepada seramida C26 akan memudahkan kemasukannya ke dalam ERES yang berkaitan, dan pada masa yang sama, mengecualikan rembesan transmembran memasuki ERES tertentu ini (Rajah 1 dan 2). Sebaliknya, kehadiran seramida C18-C16 dalam membran ER tidak menyebabkan GPI-AP membentuk rantau atau kelompok, jadi ia tidak mengecualikan atau menggantikan protein yang dirembeskan transmembran ke dalam ERES yang sama (Rajah 3 dan 4). Oleh itu, kami mencadangkan bahawa seramida C26 memacu pemisahan dan pengelasan dengan memudahkan pengelompokan protein yang dikaitkan dengan ERES tertentu.
Bagaimana untuk mencapai pengelompokan yang bergantung kepada seramida C26 ini ke dalam kawasan ER tertentu? Kecenderungan seramida membran untuk terpisah secara lateral boleh menyebabkan GPI-AP dan seramida C26 membentuk lipid kecil dan tersusun serta-merta dalam persekitaran lipid membran ER yang lebih tidak teratur yang mengandungi gliserolipid yang lebih pendek dan tidak tepu. Kelompok berkualiti (17, 18). Kelompok sementara kecil ini boleh digabungkan lagi menjadi kelompok yang lebih besar dan lebih stabil selepas mengikat pada kompleks p24 (34). Selaras dengan ini, kami menunjukkan bahawa C26 Gas1-GFP perlu berinteraksi dengan kompleks p24 untuk membentuk kelompok yang lebih besar dan boleh dilihat (Rajah 3). Kompleks p24 ialah oligomer heterozigot yang terdiri daripada empat protein transmembran p24 berbeza dalam yis (35), yang menyediakan pengikatan multivalen, yang boleh menyebabkan penghubung silang kelompok GPI-AP kecil, sekali gus menghasilkan kelompok Stabil yang lebih besar (34). Interaksi antara ektodomain protein GPI-AP juga boleh menyumbang kepada pengagregatannya, seperti yang ditunjukkan semasa pengangkutan Golgi mereka dalam sel epitelium terpolarisasi mamalia (36). Walau bagaimanapun, apabila seramida C18-C16 terdapat dalam membran ER, apabila kompleks p24 mengikat kepada Gas1-GFP, kluster berasingan yang besar tidak akan terbentuk. Mekanisme asas mungkin bergantung pada sifat fizikal dan kimia khusus seramida rantai asil panjang. Kajian biofizikal membran tiruan menunjukkan bahawa walaupun kedua-dua seramida rantai asil panjang (C24) dan pendek (C18-C16) boleh menyebabkan pemisahan fasa, hanya seramida rantai asil panjang (C24) yang boleh menggalakkan Kelengkungan tinggi dan lenturan filem untuk membentuk semula filem. Melalui rujukan bersama (17, 37, 38). Telah ditunjukkan bahawa heliks transmembran TMED2, homolog manusia Emp24, berinteraksi secara selektif dengan sphingomyelin berasaskan seramida C18 dalam lobul sitoplasma (39). Menggunakan simulasi dinamik molekul (MD), kami mendapati bahawa kedua-dua seramida C18 dan C26 terkumpul di sekitar lobul sitoplasma heliks transmembran Emp24, dan ia mempunyai keutamaan yang serupa (Rajah S6). Perlu diingatkan bahawa ini menunjukkan bahawa heliks transmembran Emp24 boleh menyebabkan taburan lipid asimetri dalam membran. Ini adalah hasil terkini berdasarkan sel mamalia. Simulasi MD yang serupa juga menunjukkan kehadiran lipid eter (40). Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa seramida C26 dalam dua lobul ER26 diperkaya secara tempatan. Apabila GPI-AP dalam lobul luminal secara langsung mengikat kepada p24 multivalen dan pengumpulan seramida C26 di sekitar p24 dalam lobul sitoplasma, ia boleh menggalakkan pengagregatan Protein dan kelengkungan membran yang disertakan dijana melalui jari (41), menyebabkan GPI-AP terpisah kepada kawasan diskret bersebelahan dengan ERES, yang juga memihak kepada kawasan membran ER yang sangat melengkung (42). Laporan terdahulu menyokong mekanisme yang dicadangkan (43, 44). Pengikatan multivalen oligolektin, patogen atau antibodi kepada glikosfingolipid berasaskan seramida (GSL) pada membran plasma mencetuskan pengagregatan GSL yang besar, meningkatkan pemisahan fasa dan menyebabkan ubah bentuk dan pengantaraan membran (44). Iwabuchi dll. (43) Didapati bahawa dengan kehadiran rantai asil panjang (C24) tetapi bukan pendek (C16), ligan multivalen yang terikat pada laktosilseramid GSL mendorong pembentukan kluster besar dan invaginasi membran, dan transduksi isyarat yang dimediasi Lyn oleh sitoplasma pada risalah diinterdigitasi oleh rantai asil dalam neutrofil berganding.
Dalam sel epitelium terpolarisasi mamalia, kepekatan rangkaian anti-Golgi (TGN) ke tahap membran plasma apikal mengawal pemisahan dan pengasingan GPI-AP (10, 45). Pengagregatan ini didorong oleh oligomerisasi GPI-AP (36), tetapi ia juga mungkin bergantung pada panjang rantai seramida yang kita temui dalam yis. Walaupun GPI-AP mamalia mempunyai sauh berasaskan lipid eter, dan struktur kimianya sangat berbeza daripada seramida rantai asil yang sangat panjang, satu kajian baru-baru ini mendapati bahawa kedua-dua lipid mempunyai sifat fizikal dan kimia yang serupa secara evolusi dan fungsi (40). Oleh itu, bahagian lipid eter dalam sel mamalia mungkin serupa dengan seramida C26 dalam yis, dan peranannya adalah untuk mengaitkan dengan seramida rantai panjang dalam membran untuk menggalakkan pengagregatan dan pengasingan GPI-AP. Walaupun kemungkinan ini masih perlu diuji secara langsung, penemuan sebelumnya menyokong bahawa pengangkutan seramida rantai asil panjang ke badan Golgi tidak dijalankan oleh protein pemindahan sitoplasma, tetapi bergantung pada sintesis sauh GPI seperti yis. Oleh itu, mekanisme konservatif evolusioner nampaknya mampu mengangkut bersama secara selektif seramida rantai asil yang sangat panjang dan GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) dalam vesikel pengangkutan yang sama.
Dalam sistem sel epitelium terkutub yis dan mamalia, pengagregatan dan pemisahan GPI-AP daripada protein membran plasma lain semuanya berlaku sebelum sampai ke permukaan sel. Paladino et al. (48) mendapati bahawa pada TGN sel epitelium terkutub mamalia, pengelompokan GPI-AP bukan sahaja perlu untuk pengelasan terpilih GPI-AP kepada membran plasma apikal, tetapi juga mengawal selia organisasi pengelompokan GPI-AP dan aktiviti biologinya. Permukaan sel. Dalam yis, kajian ini menunjukkan bahawa kelompok GPI-AP yang bergantung kepada seramida C26 pada ER boleh mengawal selia organisasi kelompok dan aktiviti berfungsi GPI-AP pada membran plasma (24, 49). Selaras dengan model ini, sel GhLag1 alah kepada perencat GPI atau ubat yang menjejaskan integriti dinding sel (28), dan keperluan untuk kelompok Gas1-GFP berfungsi (49) bagi seramida hujung yang diunjurkan dalam mengawan sel yis menunjukkan G​​​ Kemungkinan akibat fisiologi sel hLag1. Ralat GPI-AP. Walau bagaimanapun, pengujian selanjutnya sama ada organisasi fungsi permukaan sel telah diprogramkan daripada ER melalui kaedah pengisihan berdasarkan panjang lipid akan menjadi subjek penyelidikan masa depan kami.
Strain Saccharomyces cerevisiae yang digunakan dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual S1. Strain MMY1583 dan MMY1635 SCLIM untuk pengimejan sel hidup dibina di latar belakang W303. Strain ini yang mengekspresikan Sec13-mCherry dengan tag protein pendarfluor dibina menggunakan kaedah berasaskan tindak balas rantai polimerase (PCR) dengan plasmid pFA6a sebagai templat (23). Strain yang mengekspresikan Mid2-iRFP yang dilabelkan dengan protein pendarfluor di bawah kawalan promoter GAL1 dibina seperti berikut. Penguatan PCR jujukan iRFP-KanMx daripada vektor pKTiRFP-KAN (hadiah E. O'Shea, nombor plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; pengecam sumber penyelidikan (RRID): Addgene_64687) Dan dimasukkan ke dalam C-terminus Mid2 endogen. Selepas jujukan genom Mid2-iRFP dikuatkan dan diklonkan ke dalam promoter GAL1, ia telah disepadukan ke dalam tapak Not I-Sac I bagi plasmid penyepaduan pRS306. Plasmid pRGS7 yang terhasil telah dilinearkan dengan Pst I untuk disepadukan ke dalam lokus URA3.
Gen gabungan Gas1-GFP diekspresikan di bawah kawalan promoter GAL1 dalam plasmid sentromer (CEN), yang dibina seperti berikut. Urutan Gas1-GFP telah dikuatkan oleh PCR daripada plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiah L. Popolo) dan diklonkan ke dalam tapak Xma I–Xho I bagi plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah C). Miller; Nombor plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid yang terhasil dinamakan pRGS6. Gen gabungan Axl2-GFP juga diekspresikan di bawah kawalan promoter GAL1 bagi vektor pBEVY-GL LEU2, dan pembinaannya adalah seperti berikut. Urutan Axl2-GFP telah dikuatkan daripada plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) melalui PCR, dan diklonkan ke dalam tapak Bam HI-Pst I bagi vektor pBEVY-GL LEU2. Plasmid yang terhasil dinamakan pRGS12. Urutan oligonukleotida yang digunakan dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual S2.
Strain ini telah ditambah dengan 0.2% adenina dan 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-raffinose] ekstrak yis kaya protein p (YP) medium (1% Ekstrak yis dan 2% protein ept). (YPR)] atau 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] sebagai sumber karbon, atau dalam medium minimum sintetik (0.15% bes nitrogen yis dan 0.5% ammonium sulfat) untuk menambah asid amino dan bes yang sesuai yang diperlukan untuk pemakanan, dan mengandungi 2% glukosa (medium minimum glukosa sintetik) atau 2% galaktosa (medium minimum galaktosa sintetik) sebagai sumber karbon.
Untuk pengimejan masa nyata, sel mutan sec31-1 sensitif suhu yang mengekspresikan konstruk di bawah promoter GAL1 telah ditumbuhkan dalam medium YPR pada suhu 24°C semalaman hingga fasa pertengahan log. Selepas induksi dalam YPG pada suhu 24°C selama 1 jam, sel-sel telah diinkubasi dalam SG pada suhu 37°C selama 30 minit, dan kemudian dipindahkan kepada 24°C untuk dibebaskan daripada blok rembesan. Concanavalin A telah digunakan untuk melekatkan sel pada slaid kaca dan diimejkan oleh SCLIM. SCLIM ialah gabungan mikroskop pendarfluor terbalik Olympus IX-71 dan kanta minyak apertur berangka UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), pengimbas confocal cakera berputar nisbah isyarat-ke-hingar berkelajuan tinggi dan tinggi (Yokogawa Electric), spektrometer tersuai dan penyejukan tersuai. Penguat imej sistem (Hamamatsu Photonics) boleh menyediakan sistem kanta pembesar dengan pembesaran akhir ×266.7 dan kamera peranti gandingan cas yang mendarabkan elektron (Hamamatsu Photonics) (21). Pemerolehan imej dilakukan oleh perisian tersuai (Yokogawa Electric). Untuk imej 3D, kami menggunakan penggerak piezoelektrik buatan khas untuk menggetarkan kanta objektif secara menegak dan mengumpul bahagian optik pada jarak 100 nm dalam tindanan. Imej tindanan-Z ditukar menjadi data voksel 3D dan fungsi sebaran titik teori yang digunakan untuk mikroskop confocal cakera berputar digunakan untuk pemprosesan dekonvolusi oleh perisian Volocity (PerkinElmer). Dengan menggunakan perisian Volocity untuk menetapkan ambang secara automatik bagi analisis lokasi bersama, ERES termasuk kargo telah diukur. Analisis imbasan garisan telah dilakukan menggunakan perisian MetaMorph (Molecular Devices).
Gunakan perisian GraphPad Prism untuk menentukan kepentingan statistik. Bagi ujian-t Pelajar dua hujung dan ujian analisis varians sehala biasa (ANOVA), perbezaan antara kumpulan dianggap mempunyai kesan yang ketara terhadap P <0.05 (*).
Untuk mikroskopi pendarfluor Gas1-GFP, sel fasa log ditumbuhkan semalaman dalam YPD dan dikumpulkan melalui sentrifugasi, dibasuh dua kali dengan garam penimbal fosfat, dan diinkubasi di atas ais selama sekurang-kurangnya 15 minit, dan kemudian dijalankan di bawah mikroskop seperti yang diterangkan sebelum ini Semak (24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) yang dilengkapi dengan kanta objektif, penapis L5 (GFP), kamera Hamamatsu dan perisian Application Suite X (LAS X) telah digunakan untuk pemerolehan.
Sampel telah dinyahturasi dengan penimbal sampel SDS pada suhu 65°C selama 10 minit, dan kemudian dipisahkan melalui elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Untuk analisis imunoblotting, 10 μl sampel telah dimuatkan setiap lorong. Antibodi primer: Gunakan anti-Gas1 poliklonal arnab pada pencairan 1:3000, anti-Emp24 poliklonal arnab pada pencairan 1:500, dan anti-GFP poliklonal arnab (hadiah daripada H. Riezman) pada pencairan 1:3000. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal tikus telah digunakan pada pencairan 1:5000 (hadiah daripada J. de la Cruz). Antibodi sekunder: Imunoglobulin G (IgG) anti-arnab kambing terkonjugasi peroksidase lobak kuda (HRP) yang digunakan pada pencairan 1:3000 (Pierce). IgG anti-tikus kambing terkonjugasi HRP telah digunakan pada pencairan 1:3000 (Pierce). Zon tindak balas imun diperhatikan melalui kaedah kemiluminesen reagen SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Seperti yang diterangkan dalam (31), satu eksperimen imunopresipitasi semula jadi telah dijalankan pada pecahan ER yang diperkaya. Pendek kata, basuh sel yis dengan penimbal TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida dan campuran perencat protease) pada 600 nm (OD600) pada ketumpatan optik 100 dua kali. Ia dipecahkan dengan manik kaca, dan kemudian serpihan sel dan manik kaca dibuang melalui sentrifugasi. Supernatan kemudiannya disentrifugasi pada 17,000 g selama 15 minit pada suhu 4°C. Pelet tersebut digantung semula dalam TNE dan saponin digitalis ditambah kepada kepekatan akhir 1%. Suspensi tersebut diinkubasi selama 1 jam dengan putaran pada suhu 4°C, dan kemudian komponen yang tidak larut dibuang melalui sentrifugasi pada 13,000 g pada suhu 4°C selama 60 minit. Untuk imunopresipitasi Gas1-GFP, pertama sekali, pra-inkubasi sampel dengan manik agarose kosong (ChromoTek) pada suhu 4°C selama 1 jam, dan kemudian inkubasi dengan GFP-Trap_A (ChromoTek) pada suhu 4°C selama 3 jam. Manik-manik yang telah diimunopresipitasi dibasuh lima kali dengan TNE yang mengandungi 0.2% digoxigenin, dielusi dengan penimbal sampel SDS, diasingkan pada SDS-PAGE, dan dianalisis melalui imunoblotting.
Seperti yang diterangkan dalam (31), penentuan ikatan silang telah dilakukan pada pecahan ER yang diperkaya. Secara ringkas, pecahan ER yang diperkaya telah diinkubasi dengan 0.5 mM ditiobis (suksinimidil propionat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Tindak balas ikatan silang telah dipadamkan dengan menambah glisina (kepekatan akhir 50 mM, 5 minit, 20°C).
Seperti yang diterangkan sebelum ini (50), analisis MS bagi seramida dalam strain jenis liar dan GhLag1 telah dijalankan. Pendek kata, sel telah ditumbuhkan kepada fasa eksponen (3 hingga 4 OD600 unit/ml) dalam YPD pada suhu 30°C, dan 25×107 sel telah dituai. Metabolisme mereka dipadamkan dengan asid trikloroasetik. Gunakan pelarut pengekstrakan [etanol, air, eter, piridina dan 4.2 N ammonium hidroksida (15:15:5:1:0.018 v/v)] dan 1.2 nmol piawai dalaman seramida C17 (860517, lipid polar Avanti)). Gunakan reagen monometilamina [metanol, air, n-butanol dan larutan metilamina (4:3:1:5 v/v)] untuk melakukan hidrolisis alkali ringan ekstrak, dan kemudian gunakan n-butanol tepu air untuk menyahgaram. Akhir sekali, ekstrak tersebut telah digantung semula dalam pelarut mod positif [kloroform/metanol/air (2:7:1) + 5 mM ammonium asetat] dan disuntik ke dalam spektrometer jisim. Pemantauan tindak balas berbilang (MRM) telah dilakukan untuk pengenalpastian dan pengkuantitian molekul sfingolipid. Spektrometer jisim kuadrupol tertiari TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) dilengkapi dengan sumber ion nanoaliran robotik Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) untuk analisis lipid. Tenaga perlanggaran dioptimumkan untuk setiap kategori seramida. Data MS diperoleh dalam mod positif. Bagi setiap replikasi biologi, isyarat lipid ialah median bagi tiga ukuran bebas.
Seperti yang diterangkan dalam (31), sel-sel (800×107) yang mengekspresikan Gas1-GFP telah menjalani imunopresipitasi semula jadi. Gas1-GFP yang telah ditulenkan telah dipisahkan oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF). Protein tersebut divisualisasikan dengan mewarnakan PVDF dengan amida hitam. Jalur Gas1-GFP dipotong daripada PVDF dan dibasuh sebanyak 5 kali dengan metanol dan sekali dengan air gred kromatografi cecair-MS (LC-MS). Dengan mengeram jalur membran dengan 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), penimbal dan 500μl campuran natrium nitrit 1 M yang baru dilarutkan pada suhu 37°C selama 3 jam, pecahan lipid dilepaskan daripada Gas1-GFP dan dilisiskan. Pembebasan inosina fosfat seramida antara glukosamina dan inositol (51). Selepas itu, jalur membran dibasuh empat kali dengan air gred LC-MS, dikeringkan pada suhu bilik, dan disimpan dalam atmosfera nitrogen pada -80°C sehingga analisis. Sebagai kawalan, sampel kosong membran PVDF digunakan untuk setiap eksperimen. Lipid yang diekstrak daripada Gas1-GFP kemudiannya dianalisis oleh MS seperti yang diterangkan (50). Pendek kata, jalur PVDF yang mengandungi GPI-lipid telah digantung semula dalam 75μl pelarut acuan negatif [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM ammonium asetat] dan lulus Analisis pengionan elektrosemburan (ESI)-MRM/MS bagi spesies sphingolipid (TSQ Vantage). Dalam kes ini, data MS diperoleh dalam mod ion negatif.
Seperti yang dinyatakan sebelum ini, bahagian lipid sauh GPI telah diasingkan daripada GPI-AP berlabel [3H]-inositol (16). Lipid telah diasingkan melalui kromatografi lapisan nipis menggunakan sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0.25% KCl) dan divisualisasikan menggunakan FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel yang mengekspresikan Gas1-GFP (600×107) dibasuh dua kali dengan penimbal TNE dengan penimbal TNE, dan dipecahkan dengan manik kaca, kemudian disentrifugasi untuk membuang serpihan sel dan manik kaca. Supernatan kemudiannya disentrifugasi pada 17,000 g selama 1 jam pada suhu 4°C. Pelet dibasuh dalam TNE dan diinkubasi dengan 1 U PI-PLC (Invitrogen) dalam TNE yang mengandungi 0.2% saponin digitalis selama 1 jam pada suhu 37°C. Selepas rawatan enzim, membran telah dibuang melalui sentrifugasi pada 17,000 g pada suhu 4°C selama 1 jam. Untuk imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan telah diinkubasi dengan GFP-Trap_A (ChromoTek) pada suhu 4°C semalaman. Gas1-GFP yang telah ditulenkan yang dipisahkan oleh SDS-PAGE telah diwarnakan dengan warna biru terang Coomassie. Jalur pewarnaan Gas1-GFP dipotong daripada kelabu yang mengelilingi akueduk, dan kemudian selepas alkilasi dengan iodoasetamida dan pengurangan dengan ditiotreitol, pencernaan dalam gel dengan tripsin telah dilakukan. Ekstrak dan peptida triptik kering dan peptida dengan GPI-glikan. Peptida kering dilarutkan dalam 20 μl air. Suntikkan sebahagian (8μl) ke dalam LC. Lajur oktadesilsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter dalam 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Wilayah Aichi, Jepun) telah digunakan untuk memisahkan peptida di bawah keadaan kecerunan tertentu. Fasa bergerak ialah pelarut A (0.08% asid formik) dan pelarut B (0.15% asid formik dalam 80% asetonitril). Sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) telah digunakan untuk mengelusi turus dengan pelarut A dalam masa 55 minit pada kadar aliran 50 μl min-1 selama 5 minit, dan kemudian kepekatan pelarut B ditingkatkan kepada 40%. (Amerika Syarikat). Eluat dimasukkan secara berterusan ke dalam sumber ion ESI, dan peptida triptik dan peptida dengan GPI-glikan dianalisis oleh LTQ Orbitrap XL (spektrometer jisim perangkap ion linear hibrid-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Dalam persediaan MS, voltan sumber kapilari ditetapkan kepada 4.5 kV, dan suhu kapilari pemindahan dikekalkan pada 300°C. Voltan kapilari dan voltan kanta tiub ditetapkan kepada 15 V dan 50 V, masing-masing. Data MS diperoleh dalam mod ion positif (resolusi 60,000; ketepatan jisim 10 bahagian per juta) dalam julat jisim 300/m/z nisbah jisim/cas (m/z) 3000. Data MS/MS diperoleh melalui perangkap ion dalam LTQ Orbitrap XL [3 digit pertama yang bergantung kepada data, penceraian akibat perlanggaran (CID)].
Simulasi MD telah dijalankan menggunakan perisian GROMACS (52) dan medan daya MARTINI 2 (53-55). Pembina Membran CHARMM GUI (56, 57) kemudiannya digunakan untuk membina dwilapisan yang mengandungi dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) dan Cer C18 atau DOPC dan Cer C26. Topologi dan koordinat Cer C26 diperoleh daripada DXCE dengan membuang manik tambahan daripada ekor sfingosin. Gunakan proses yang diterangkan di bawah untuk mengimbangi lapisan berganda dan jalankannya, kemudian gunakan koordinat terakhir sistem untuk membina sistem yang mengandungi Emp24. Domain transmembran yis Emp24 (residu 173 hingga 193) dibina sebagai α-heliks menggunakan struktur molekul alat visual MD (VMD) (58). Kemudian, selepas membuang lipid yang bertindih, protein tersebut digranulkan secara kasar dan dimasukkan ke dalam dwilapisan menggunakan CHARMM GUI. Sistem akhir mengandungi 1202 DOPC dan 302 Cer C26 atau 1197 DOPC dan 295 Cer C18 dan Emp24. Ionkan sistem kepada kepekatan 0.150M. Empat replika bebas telah dibuat untuk dua komposisi dwilapisan.
Dwilapisan lipid diseimbangkan menggunakan proses CHARMM GUI, yang melibatkan meminimumkan dan kemudian mengimbangi 405,000 langkah, di mana kekangan kedudukan dikurangkan dan dihapuskan secara beransur-ansur, dan langkah masa ditingkatkan daripada 0.005 ps kepada 0.02 ps. Selepas keseimbangan, ia menghasilkan 6 µs dengan langkah masa 0.02 ps. Selepas memasukkan Emp24, gunakan proses CHARMM GUI yang sama untuk meminimumkan dan mengimbangi sistem, dan kemudian jalankan selama 8 saat dalam pengeluaran.
Bagi semua sistem, semasa proses pengimbangan, tekanan dikawal oleh barostat Berendsen (59), dan semasa proses pengeluaran, tekanan dikawal oleh barostat Parrinello-Rahman (60). Dalam semua kes, tekanan purata ialah 1 bar dan skema gandingan tekanan separa isotropik digunakan. Dalam proses pengimbangan dan pengeluaran, termostat (61) dengan penentukuran semula kelajuan digunakan untuk masing-masing menggabungkan suhu protein, lipid dan zarah pelarut. Semasa keseluruhan operasi, suhu sasaran ialah 310K. Interaksi tanpa ikatan dikira dengan menjana senarai pasangan menggunakan skema Verlet dengan toleransi penimbal 0.005. Istilah Coulomb dikira menggunakan medan tindak balas dan jarak pemotongan 1.1 nm. Istilah Vander Waals menggunakan skema pemotongan dengan jarak pemotongan 1.1 nm, dan skema pemotongan Verlet digunakan untuk hanyutan berpotensi (62).
Menggunakan VMD, panjang gelombang pemotongan antara manik fosfat DOPC atau manik seramida AM1 dan protein ialah 0.7 nm, dan bilangan lipid yang berinteraksi dengan protein dikira. Mengikut formula berikut, kirakan faktor pengayaan susulan (DE) seperti dalam (63): Faktor DE = (jumlah lipid keseluruhan dalam protein 0.7) dalam protein 0.7 (jumlah Cer dalam lipid keseluruhan)
Nilai yang dilaporkan diperoleh sebagai purata, dan bar ralat adalah empat salinan bebas SE. Kepentingan statistik faktor DE dikira dengan ujian t [(purata-faktor DE-1)/SE]. Kira nilai P daripada taburan satu hujung.
Alat GROMACS digunakan untuk mengira peta ketumpatan lateral 2D sistem yang mengandungi Emp24 dalam lingkungan 250 ns terakhir jejak. Untuk mendapatkan peta pengayaan/penipisan seramida, peta ketumpatan Cer dibahagikan dengan jumlah peta Cer dan DOPC, dan kemudian dibahagikan dengan kepekatan Cer dalam jasad. Skala peta warna yang sama digunakan.
Untuk bahan tambahan bagi artikel ini, sila lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ini merupakan artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah terma Lesen Creative Commons Atribusi-Bukan-Komersial, yang membenarkan penggunaan, pengedaran dan penghasilan semula dalam sebarang medium, selagi penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah karya asal adalah betul. Rujukan.
Nota: Kami hanya meminta anda memberikan alamat e-mel anda supaya orang yang anda cadangkan ke halaman tersebut tahu bahawa anda mahu mereka melihat e-mel tersebut dan ia bukan spam. Kami tidak akan merekodkan sebarang alamat e-mel.
Soalan ini digunakan untuk menguji sama ada anda seorang pelawat dan mencegah penyerahan spam automatik.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero, Misaho Lopez (Sergio Lopez), Misaho Lopez (Sergio Wagez -Linero), Sergio Lopez Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pengimejan masa nyata resolusi tinggi 3D mendedahkan kepentingan panjang rantai seramida untuk penyisihan protein di tapak output terpilih.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero, Misaho Lopez (Sergio Lopez), Misaho Lopez (Sergio Wagez -Linero), Sergio Lopez Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pengimejan masa nyata resolusi tinggi 3D mendedahkan kepentingan panjang rantai seramida untuk penyisihan protein di tapak output terpilih.
©2020 Persatuan Amerika untuk Kemajuan Sains. semua hak terpelihara. AAAS ialah rakan kongsi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.