Terima kasih kerana melayari nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan menggunakan versi pelayar terkini (atau mematikan mod keserasian dalam Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan sokongan berterusan, laman web ini tidak akan menyertakan gaya atau JavaScript.
Hidrogen sulfida (H2S) mempunyai pelbagai kesan fisiologi dan patologi pada tubuh manusia. Natrium hidrosulfida (NaHS) digunakan secara meluas sebagai alat farmakologi untuk menilai kesan H2S dalam eksperimen biologi. Walaupun kehilangan H2S daripada larutan NaHS hanya mengambil masa beberapa minit, larutan NaHS telah digunakan sebagai sebatian penderma untuk H2S dalam air minuman dalam beberapa kajian haiwan. Kajian ini menyiasat sama ada air minuman dengan kepekatan NaHS 30 μM yang disediakan dalam botol tikus/mencit boleh kekal stabil selama sekurang-kurangnya 12–24 jam, seperti yang dicadangkan oleh beberapa penulis. Sediakan larutan NaHS (30 μM) dalam air minuman dan segera tuangkannya ke dalam botol air tikus/mencit. Sampel dikumpulkan dari hujung dan bahagian dalam botol air pada 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 dan 24 jam untuk mengukur kandungan sulfida menggunakan kaedah metilena biru. Di samping itu, tikus jantan dan betina telah disuntik dengan NaHS (30 μM) selama dua minggu dan kepekatan serum sulfida diukur setiap selang hari pada minggu pertama dan pada akhir minggu kedua. Larutan NaHS dalam sampel yang diperoleh dari hujung botol air adalah tidak stabil; ia menurun masing-masing sebanyak 72% dan 75% selepas 12 dan 24 jam. Dalam sampel yang diperoleh dari bahagian dalam botol air, penurunan NaHS tidak ketara dalam masa 2 jam; walau bagaimanapun, ia menurun masing-masing sebanyak 47% dan 72% selepas 12 dan 24 jam. Suntikan NaHS tidak menjejaskan tahap serum sulfida tikus jantan dan betina. Kesimpulannya, larutan NaHS yang disediakan daripada air minuman tidak boleh digunakan untuk pendermaan H2S kerana larutan tersebut tidak stabil. Kaedah pemberian ini akan mendedahkan haiwan kepada jumlah NaHS yang tidak teratur dan lebih kecil daripada yang dijangkakan.
Hidrogen sulfida (H2S) telah digunakan sebagai toksin sejak tahun 1700; walau bagaimanapun, kemungkinan peranannya sebagai molekul bioisyarat endogen telah diterangkan oleh Abe dan Kimura pada tahun 1996. Sepanjang tiga dekad yang lalu, pelbagai fungsi H2S dalam pelbagai sistem manusia telah dijelaskan, yang membawa kepada kesedaran bahawa molekul penderma H2S mungkin mempunyai aplikasi klinikal dalam rawatan atau pengurusan penyakit tertentu; lihat Chirino et al. untuk ulasan terkini.
Natrium hidrosulfida (NaHS) telah digunakan secara meluas sebagai alat farmakologi untuk menilai kesan H2S dalam banyak kajian kultur sel dan haiwan5,6,7,8. Walau bagaimanapun, NaHS bukanlah penderma H2S yang ideal kerana ia cepat ditukar kepada H2S/HS- dalam larutan, mudah tercemar dengan polisulfida, dan mudah dioksidakan dan diuap4,9. Dalam banyak eksperimen biologi, NaHS dilarutkan dalam air, mengakibatkan pengewapan pasif dan kehilangan H2S10,11,12, pengoksidaan spontan H2S11,12,13, dan fotolisis14. Sulfida dalam larutan asal hilang dengan sangat cepat disebabkan oleh pengewapan H2S11. Dalam bekas terbuka, separuh hayat (t1/2) H2S adalah kira-kira 5 minit, dan kepekatannya berkurangan kira-kira 13% seminit10. Walaupun kehilangan hidrogen sulfida daripada larutan NaHS hanya mengambil masa beberapa minit, beberapa kajian haiwan telah menggunakan larutan NaHS sebagai sumber hidrogen sulfida dalam air minuman selama 1–21 minggu, menggantikan larutan yang mengandungi NaHS setiap 12–24 jam.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Amalan ini tidak selaras dengan prinsip penyelidikan saintifik, kerana dos ubat harus berdasarkan penggunaannya dalam spesies lain, terutamanya manusia.27
Penyelidikan praklinikal dalam bioperubatan bertujuan untuk meningkatkan kualiti penjagaan pesakit atau hasil rawatan. Walau bagaimanapun, keputusan kebanyakan kajian haiwan masih belum diterjemahkan kepada manusia28,29,30. Salah satu sebab kegagalan translasi ini adalah kurangnya perhatian terhadap kualiti metodologi kajian haiwan30. Oleh itu, tujuan kajian ini adalah untuk menyiasat sama ada larutan NaHS 30 μM yang disediakan dalam botol air tikus/mencit boleh kekal stabil dalam air minuman selama 12–24 jam, seperti yang didakwa atau dicadangkan dalam beberapa kajian.
Semua eksperimen dalam kajian ini dijalankan mengikut garis panduan yang diterbitkan untuk penjagaan dan penggunaan haiwan makmal di Iran31. Semua laporan eksperimen dalam kajian ini juga mematuhi garis panduan ARRIVE32. Jawatankuasa Etika Institut Sains Endokrin, Universiti Sains Perubatan Shahid Beheshti, telah meluluskan semua prosedur eksperimen dalam kajian ini.
Zink asetat dihidrat (CAS: 5970-45-6) dan ferik klorida anhidrus (CAS: 7705-08-0) telah dibeli daripada Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Perancis). Natrium hidrosulfida hidrat (CAS: 207683-19-0) dan N,N-dimetil-p-fenilenediamina (DMPD) (CAS: 535-47-0) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Isoflurana telah dibeli daripada Piramal (Bethlehem, PA, Amerika Syarikat). Asid hidroklorik (HCl) telah dibeli daripada Merck (Darmstadt, Jerman).
Sediakan larutan NaHS (30 μM) dalam air minuman dan segera tuangkannya ke dalam botol air tikus/mencit. Kepekatan ini dipilih berdasarkan pelbagai penerbitan yang menggunakan NaHS sebagai sumber H2S; lihat bahagian Perbincangan. NaHS ialah molekul terhidrat yang boleh mengandungi jumlah air penghidratan yang berbeza-beza (iaitu, NaHS•xH2O); menurut pengilang, peratusan NaHS yang digunakan dalam kajian kami ialah 70.7% (iaitu, NaHS•1.3 H2O), dan kami mengambil kira nilai ini dalam pengiraan kami, di mana kami menggunakan berat molekul 56.06 g/mol, iaitu berat molekul NaHS anhidrus. Air penghidratan (juga dipanggil air penghabluran) ialah molekul air yang membentuk struktur kristal33. Hidrat mempunyai sifat fizikal dan termodinamik yang berbeza berbanding anhidrat34.
Sebelum menambah NaHS ke dalam air minuman, ukur pH dan suhu pelarut. Tuangkan larutan NaHS dengan segera ke dalam botol air tikus/tikus di dalam sangkar haiwan. Sampel dikumpulkan dari hujung dan dari bahagian dalam botol air pada 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, dan 24 jam untuk mengukur kandungan sulfida. Pengukuran sulfida diambil sejurus selepas setiap persampelan. Kami memperoleh sampel dari hujung tiub kerana beberapa kajian menunjukkan bahawa saiz liang tiub air yang kecil dapat meminimumkan penyejatan H2S15,19. Isu ini nampaknya turut terpakai pada larutan di dalam botol. Walau bagaimanapun, ini tidak berlaku untuk larutan di leher botol air, yang mempunyai kadar penyejatan yang lebih tinggi dan mengalami pengoksidaan automatik; sebenarnya, haiwan minum air ini terlebih dahulu.
Tikus Wistar jantan dan betina telah digunakan dalam kajian ini. Tikus-tikus tersebut ditempatkan di dalam sangkar polipropilena (2–3 tikus setiap sangkar) di bawah keadaan standard (suhu 21–26 °C, kelembapan 32–40%) dengan 12 jam cahaya (7 pagi hingga 7 petang) dan 12 jam kegelapan (7 malam hingga 7 pagi). Tikus-tikus tersebut mempunyai akses percuma ke air paip dan diberi makan makanan standard (Khorak Dam Pars Company, Tehran, Iran). Tikus betina (n=10, berat badan: 190–230 g) dan jantan (n=10, berat badan: 320–370 g) yang dipadankan umurnya secara rawak dibahagikan kepada kumpulan kawalan dan NaHS (30 μM) yang dirawat (n=5 setiap kumpulan). Untuk menentukan saiz sampel, kami menggunakan pendekatan KISS (Keep It Simple, Stupid), yang menggabungkan pengalaman sebelumnya dan analisis kuasa35. Kami mula-mula menjalankan kajian rintis ke atas 3 ekor tikus dan menentukan purata tahap sulfida serum total dan sisihan piawai (8.1 ± 0.81 μM). Kemudian, dengan mempertimbangkan kuasa 80% dan mengandaikan tahap keertian dua sisi 5%, kami menentukan saiz sampel awal (n = 5 berdasarkan literatur terdahulu) yang sepadan dengan saiz kesan piawai 2.02 dengan nilai pratakrif yang dicadangkan oleh Festing untuk mengira saiz sampel haiwan uji kaji35. Selepas mendarabkan nilai ini dengan SD (2.02 × 0.81), saiz kesan yang boleh dikesan yang diramalkan (1.6 μM) ialah 20%, yang boleh diterima. Ini bermakna n = 5/kumpulan mencukupi untuk mengesan perubahan purata 20% antara kumpulan. Tikus dibahagikan secara rawak kepada kumpulan kawalan dan kumpulan yang dirawat NaSH menggunakan fungsi rawak perisian Excel 36 (Rajah Tambahan 1). Blinding dilakukan pada peringkat hasil, dan penyiasat yang melakukan pengukuran biokimia tidak menyedari tugasan kumpulan.
Kumpulan NaHS bagi kedua-dua jantina telah dirawat dengan larutan NaHS 30 μM yang disediakan dalam air minuman selama 2 minggu; Larutan segar dibekalkan setiap 24 jam, dan dalam tempoh tersebut berat badan diukur. Sampel darah dikumpulkan dari hujung ekor semua tikus di bawah anestesia isoflurane setiap selang sehari pada akhir minggu pertama dan kedua. Sampel darah disentrifugasi pada 3000 g selama 10 minit, serum diasingkan dan disimpan pada suhu –80°C untuk pengukuran urea serum, kreatinin (Cr), dan jumlah sulfida seterusnya. Urea serum ditentukan dengan kaedah urease enzimatik, dan kreatinin serum ditentukan dengan kaedah Jaffe fotometrik menggunakan kit yang tersedia secara komersial (Man Company, Tehran, Iran) dan penganalisis automatik (Selectra E, nombor siri 0-2124, Belanda). Pekali variasi intra dan interassay untuk urea dan Cr adalah kurang daripada 2.5%.
Kaedah metilena biru (MB) digunakan untuk mengukur jumlah sulfida dalam air minuman dan serum yang mengandungi NaHS; MB adalah kaedah yang paling biasa digunakan untuk mengukur sulfida dalam larutan pukal dan sampel biologi11,37. Kaedah MB boleh digunakan untuk menganggarkan jumlah kolam sulfida38 dan mengukur sulfida bukan organik dalam bentuk H2S, HS- dan S2 dalam fasa akueus39. Dalam kaedah ini, sulfur dimendakkan sebagai zink sulfida (ZnS) dengan kehadiran zink asetat11,38. Pemendakan zink asetat adalah kaedah yang paling banyak digunakan untuk memisahkan sulfida daripada kromofor lain11. ZnS dilarutkan semula menggunakan HCl11 di bawah keadaan berasid kuat. Sulfida bertindak balas dengan DMPD dalam nisbah stoikiometri 1:2 dalam tindak balas yang dimangkinkan oleh ferik klorida (Fe3+ bertindak sebagai agen pengoksida) untuk membentuk pewarna MB, yang dikesan secara spektrofotometri pada 670 nm40,41. Had pengesanan kaedah MB adalah lebih kurang 1 μM11.
Dalam kajian ini, 100 μL setiap sampel (larutan atau serum) telah ditambah ke dalam tiub; kemudian 200 μL zink asetat (1% w/v dalam air suling), 100 μL DMPD (20 mM dalam 7.2 M HCl), dan 133 μL FeCl3 (30 mM dalam 1.2 M HCl) telah ditambah. Campuran diinkubasi pada suhu 37°C dalam keadaan gelap selama 30 minit. Larutan tersebut disentrifugasi pada 10,000 g selama 10 minit, dan penyerapan supernatan dibaca pada 670 nm menggunakan pembaca mikroplat (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Kepekatan sulfida ditentukan menggunakan lengkung penentukuran NaHS (0–100 μM) dalam ddH2O (Rajah Tambahan 2). Semua larutan yang digunakan untuk pengukuran telah disediakan dengan segar. Pekali variasi intra- dan interassay untuk pengukuran sulfida masing-masing adalah 2.8% dan 3.4%. Kami juga menentukan jumlah sulfida yang diperoleh daripada sampel air minuman dan serum yang mengandungi natrium tiosulfat menggunakan kaedah sampel yang diperkaya42. Pemulihan untuk sampel air minuman dan serum yang mengandungi natrium tiosulfat masing-masing adalah 91 ± 1.1% (n = 6) dan 93 ± 2.4% (n = 6).
Analisis statistik telah dijalankan menggunakan perisian GraphPad Prism versi 8.0.2 untuk Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Ujian-t berpasangan telah digunakan untuk membandingkan suhu dan pH air minuman sebelum dan selepas penambahan NaHS. Kehilangan H2S dalam larutan yang mengandungi NaHS dikira sebagai peratusan penurunan daripada pengambilan garis dasar, dan untuk menilai sama ada kehilangan tersebut adalah signifikan secara statistik, kami menjalankan ANOVA ukuran berulang sehala diikuti dengan ujian perbandingan berganda Dunnett. Berat badan, urea serum, kreatinin serum dan jumlah serum sulfida dari semasa ke semasa telah dibandingkan antara tikus kawalan dan tikus yang dirawat NaHS yang berlainan jantina menggunakan ANOVA campuran dua hala (antara-dalam) diikuti dengan ujian post hoc Bonferroni. Nilai P dua hujung < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.
pH air minuman adalah 7.60 ± 0.01 sebelum penambahan NaHS dan 7.71 ± 0.03 selepas penambahan NaHS (n = 13, p = 0.0029). Suhu air minuman adalah 26.5 ± 0.2 dan menurun kepada 26.2 ± 0.2 selepas penambahan NaHS (n = 13, p = 0.0128). Sediakan 30 μM larutan NaHS dalam air minuman dan simpannya di dalam botol air. Larutan NaHS tidak stabil dan kepekatannya berkurangan dari semasa ke semasa. Apabila persampelan dari leher botol air, penurunan yang ketara (68.0%) diperhatikan dalam masa sejam pertama, dan kandungan NaHS dalam larutan menurun masing-masing sebanyak 72% dan 75% selepas 12 dan 24 jam. Dalam sampel yang diperoleh daripada botol air, pengurangan NaHS tidak ketara sehingga 2 jam, tetapi selepas 12 dan 24 jam ia telah menurun masing-masing sebanyak 47% dan 72%. Data ini menunjukkan bahawa peratusan NaHS dalam larutan 30 μM yang disediakan dalam air minuman telah menurun kepada kira-kira satu perempat daripada nilai awal selepas 24 jam, tanpa mengira lokasi persampelan (Rajah 1).
Kestabilan larutan NaHS (30 μM) dalam air minuman dalam botol tikus/mencit. Selepas penyediaan larutan, sampel diambil dari hujung dan bahagian dalam botol air. Data dibentangkan sebagai min ± SD (n = 6/kumpulan). * dan #, P < 0.05 berbanding masa 0. Gambar botol air menunjukkan hujung (dengan bukaan) dan badan botol. Isipadu hujung adalah lebih kurang 740 μL.
Kepekatan NaHS dalam larutan 30 μM yang baru disediakan ialah 30.3 ± 0.4 μM (julat: 28.7–31.9 μM, n = 12). Walau bagaimanapun, selepas 24 jam, kepekatan NaHS menurun kepada nilai yang lebih rendah (min: 3.0 ± 0.6 μM). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, kepekatan NaHS yang didedahkan kepada tikus adalah tidak malar semasa tempoh kajian.
Berat badan tikus betina meningkat dengan ketara dari semasa ke semasa (daripada 205.2 ± 5.2 g kepada 213.8 ± 7.0 g dalam kumpulan kawalan dan daripada 204.0 ± 8.6 g kepada 211.8 ± 7.5 g dalam kumpulan yang dirawat dengan NaHS); walau bagaimanapun, rawatan NaHS tidak memberi kesan kepada berat badan (Rajah 3). Berat badan tikus jantan meningkat dengan ketara dari semasa ke semasa (daripada 338.6 ± 8.3 g kepada 352.4 ± 6.0 g dalam kumpulan kawalan dan daripada 352.4 ± 5.9 g kepada 363.2 ± 4.3 g dalam kumpulan yang dirawat dengan NaHS); walau bagaimanapun, rawatan NaHS tidak memberi kesan kepada berat badan (Rajah 3).
Perubahan berat badan pada tikus betina dan jantan selepas pemberian NaHS (30 μM). Data dibentangkan sebagai min ± SEM dan dibandingkan menggunakan analisis varians campuran dua hala (dalam-antara) dengan ujian post hoc Bonferroni. n = 5 bagi setiap jantina dalam setiap kumpulan.
Kepekatan urea serum dan kreatin fosfat adalah setanding dalam tikus kawalan dan tikus yang dirawat NaSH sepanjang kajian. Tambahan pula, rawatan NaSH tidak menjejaskan kepekatan urea serum dan kreatinkrom (Jadual 1).
Kepekatan jumlah sulfida serum asas adalah setanding antara tikus kawalan dan tikus jantan (8.1 ± 0.5 μM vs. 9.3 ± 0.2 μM) dan betina (9.1 ± 1.0 μM vs. 6.1 ± 1.1 μM) yang dirawat dengan NaHS. Pemberian NaHS selama 14 hari tidak memberi kesan kepada tahap jumlah sulfida serum sama ada pada tikus jantan atau betina (Rajah 4).
Perubahan dalam kepekatan sulfida total serum pada tikus jantan dan betina selepas pemberian NaHS (30 μM). Data dibentangkan sebagai min ± SEM dan dibandingkan menggunakan analisis varians campuran dua hala (dalam-dalam) dengan ujian post hoc Bonferroni. Setiap jantina, n = 5/kumpulan.
Kesimpulan utama kajian ini ialah air minuman yang mengandungi NaHS adalah tidak stabil: hanya kira-kira satu perempat daripada jumlah kandungan sulfida awal yang dapat dikesan 24 jam selepas persampelan dari hujung dan dalam botol air tikus/mencit. Tambahan pula, tikus terdedah kepada kepekatan NaHS yang tidak stabil disebabkan oleh kehilangan H2S dalam larutan NaHS, dan penambahan NaHS ke dalam air minuman tidak menjejaskan berat badan, urea serum dan kreatin kromium, atau jumlah serum sulfida.
Dalam kajian ini, kadar kehilangan H2S daripada 30 μM larutan NaHS yang disediakan dalam air minuman adalah kira-kira 3% sejam. Dalam larutan penimbal (100 μM natrium sulfida dalam 10 mM PBS, pH 7.4), kepekatan sulfida dilaporkan menurun sebanyak 7% dari semasa ke semasa selama 8 jam11. Kami sebelum ini telah mempertahankan pemberian NaHS secara intraperitoneal dengan melaporkan bahawa kadar kehilangan sulfida daripada larutan NaHS 54 μM dalam air minuman adalah kira-kira 2.3% sejam (4%/jam dalam 12 jam pertama dan 1.4%/jam dalam 12 jam terakhir selepas penyediaan)8. Kajian terdahulu43 mendapati kehilangan H2S yang berterusan daripada larutan NaHS, terutamanya disebabkan oleh pengewapan dan pengoksidaan. Walaupun tanpa penambahan buih, sulfida dalam larutan stok hilang dengan cepat disebabkan oleh pengewapan H2S11. Kajian telah menunjukkan bahawa semasa proses pencairan, yang mengambil masa kira-kira 30–60 saat, kira-kira 5–10% H2S hilang akibat penyejatan6. Untuk mengelakkan penyejatan H2S daripada larutan, para penyelidik telah mengambil beberapa langkah, termasuk mengacau larutan secara perlahan12, menutup larutan stok dengan filem plastik6, dan meminimumkan pendedahan larutan kepada udara, kerana kadar penyejatan H2S bergantung pada antara muka udara-cecair.13 Pengoksidaan spontan H2S berlaku terutamanya disebabkan oleh ion logam peralihan, terutamanya besi ferik, yang merupakan bendasing dalam air.13 Pengoksidaan H2S mengakibatkan pembentukan polisulfida (atom sulfur yang dihubungkan oleh ikatan kovalen)11. Untuk mengelakkan pengoksidaannya, larutan yang mengandungi H2S disediakan dalam pelarut terdeoksigenasi44,45 dan kemudian dibilas dengan argon atau nitrogen selama 20–30 minit untuk memastikan penyahoksigenan.11,12,37,44,45,46 Asid dietilenitriaminpentaasetik (DTPA) ialah pengkelat logam (10–4 M) yang menghalang autoksidasi HS- dalam larutan aerobik. Sekiranya tiada DTPA, kadar autoksidasi HS- adalah kira-kira 50% dalam tempoh kira-kira 3 jam pada suhu 25°C37,47. Tambahan pula, memandangkan pengoksidaan 1e-sulfida dimangkinkan oleh cahaya ultraungu, larutan tersebut hendaklah disimpan di atas ais dan dilindungi daripada cahaya11.
Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5, NaHS terurai menjadi Na+ dan HS-6 apabila dilarutkan dalam air; penceraian ini ditentukan oleh pK1 tindak balas, yang bergantung pada suhu: pK1 = 3.122 + 1132/T, dengan T berkisar antara 5 hingga 30°C dan diukur dalam darjah Kelvin (K), K = °C + 273.1548. HS- mempunyai pK2 yang tinggi (pK2 = 19), jadi pada pH < 96.49, S2- tidak terbentuk atau terbentuk dalam jumlah yang sangat kecil. Sebaliknya, HS- bertindak sebagai bes dan menerima H+ daripada molekul H2O, dan H2O bertindak sebagai asid dan ditukar kepada H2S dan OH-.
Pembentukan gas H2S terlarut dalam larutan NaHS (30 µM). aq, larutan akueus; g, gas; l, cecair. Semua pengiraan mengandaikan bahawa pH air = 7.0 dan suhu air = 20 °C. Dicipta dengan BioRender.com.
Walaupun terdapat bukti bahawa larutan NaHS tidak stabil, beberapa kajian haiwan telah menggunakan larutan NaHS dalam air minuman sebagai sebatian penderma H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 dengan tempoh intervensi antara 1 hingga 21 minggu (Jadual 2). Semasa kajian ini, larutan NaHS diperbaharui setiap 12 jam, 15, 17, 18, 24, 25 jam atau 24 jam, 19, 20, 21, 22, 23 jam. Keputusan kami menunjukkan bahawa tikus terdedah kepada kepekatan ubat yang tidak stabil disebabkan oleh kehilangan H2S daripada larutan NaHS, dan kandungan NaHS dalam air minuman tikus berubah-ubah dengan ketara selama 12 atau 24 jam (lihat Rajah 2). Dua daripada kajian ini melaporkan bahawa tahap H2S dalam air kekal stabil selama 24 jam 22 hari atau hanya 2–3% kehilangan H2S diperhatikan selama 12 jam 15 hari, tetapi ia tidak memberikan data sokongan atau butiran pengukuran. Dua kajian telah menunjukkan bahawa diameter botol air yang kecil dapat meminimumkan penyejatan H2S15,19. Walau bagaimanapun, keputusan kami menunjukkan bahawa ini hanya boleh melambatkan kehilangan H2S daripada botol air selama 2 jam dan bukannya 12–24 jam. Kedua-dua kajian menyatakan bahawa kami menganggap bahawa tahap NaHS dalam air minuman tidak berubah kerana kami tidak memerhatikan perubahan warna dalam air; oleh itu, pengoksidaan H2S melalui udara tidak ketara19,20. Anehnya, kaedah subjektif ini menilai kestabilan NaHS dalam air dan bukannya mengukur perubahan kepekatannya dari semasa ke semasa.
Kehilangan H2S dalam larutan NaHS berkaitan dengan pH dan suhu. Seperti yang dinyatakan dalam kajian kami, melarutkan NaHS dalam air mengakibatkan pembentukan larutan alkali50. Apabila NaHS dilarutkan dalam air, pembentukan gas H2S terlarut bergantung pada nilai pH6. Semakin rendah pH larutan, semakin besar kadar NaHS yang terdapat sebagai molekul gas H2S dan semakin banyak sulfida yang hilang daripada larutan akueus11. Tiada satu pun daripada kajian ini melaporkan pH air minuman yang digunakan sebagai pelarut untuk NaHS. Menurut cadangan WHO, yang diguna pakai oleh kebanyakan negara, pH air minuman hendaklah berada dalam julat 6.5–8.551. Dalam julat pH ini, kadar pengoksidaan spontan H2S meningkat kira-kira sepuluh kali ganda13. Melarutkan NaHS dalam air dalam julat pH ini akan menghasilkan kepekatan gas H2S terlarut sebanyak 1 hingga 22.5 μM, yang menekankan kepentingan pemantauan pH air sebelum melarutkan NaHS. Di samping itu, julat suhu yang dilaporkan dalam kajian di atas (18–26 °C) akan mengakibatkan perubahan kepekatan gas H2S terlarut dalam larutan kira-kira 10%, kerana perubahan suhu mengubah pK1, dan perubahan kecil dalam pK1 boleh memberi impak yang ketara terhadap kepekatan gas H2S terlarut48. Di samping itu, tempoh beberapa kajian yang panjang (5 bulan)22, di mana kebolehubahan suhu yang besar dijangkakan, juga memburukkan lagi masalah ini.
Semua kajian kecuali satu21 menggunakan larutan NaHS 30 μM dalam air minuman. Untuk menjelaskan dos yang digunakan (iaitu 30 μM), beberapa penulis menunjukkan bahawa NaHS dalam fasa akueus menghasilkan kepekatan gas H2S yang sama persis dan julat fisiologi H2S adalah 10 hingga 100 μM, jadi dos ini berada dalam julat fisiologi15,16. Yang lain menjelaskan bahawa 30 μM NaHS dapat mengekalkan tahap H2S plasma dalam julat fisiologi, iaitu 5–300 μM19,20. Kami mempertimbangkan kepekatan NaHS dalam air sebanyak 30 μM (pH = 7.0, T = 20 °C), yang digunakan dalam beberapa kajian untuk mengkaji kesan H2S. Kita boleh mengira bahawa kepekatan gas H2S terlarut ialah 14.7 μM, iaitu kira-kira 50% daripada kepekatan NaHS awal. Nilai ini serupa dengan nilai yang dikira oleh penulis lain di bawah keadaan yang sama13,48.
Dalam kajian kami, pemberian NaHS tidak mengubah berat badan; keputusan ini selaras dengan keputusan kajian lain pada tikus jantan22,23 dan tikus jantan18; Walau bagaimanapun, dua kajian melaporkan bahawa NaSH memulihkan penurunan berat badan pada tikus yang telah di-nefrektomi24,26, manakala kajian lain tidak melaporkan kesan pemberian NaSH terhadap berat badan15,16,17,19,20,21,25. Tambahan pula, dalam kajian kami, pemberian NaSH tidak mempengaruhi tahap urea serum dan kreatin kromium, yang selaras dengan keputusan laporan lain25.
Kajian mendapati bahawa penambahan NaHS ke dalam air minuman selama 2 minggu tidak menjejaskan jumlah kepekatan sulfida serum pada tikus jantan dan betina. Penemuan ini selaras dengan keputusan Sen et al. (16): 8 minggu rawatan dengan 30 μM NaHS dalam air minuman tidak menjejaskan tahap sulfida plasma pada tikus kawalan; walau bagaimanapun, mereka melaporkan bahawa intervensi ini memulihkan penurunan tahap H2S dalam plasma tikus yang telah dinefrektomi. Li et al. (22) juga melaporkan bahawa rawatan dengan 30 μM NaHS dalam air minuman selama 5 bulan meningkatkan tahap sulfida bebas plasma pada tikus yang telah berusia sebanyak kira-kira 26%. Kajian lain tidak melaporkan perubahan dalam sulfida yang beredar selepas penambahan NaHS ke dalam air minuman.
Tujuh kajian melaporkan menggunakan Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 tetapi tidak memberikan butiran lanjut tentang air penghidratan, dan lima kajian tidak menyebut sumber NaHS yang digunakan dalam kaedah penyediaannya17,18,24,25,26. NaHS ialah molekul terhidrat dan kandungan air penghidratannya boleh berbeza-beza, yang mempengaruhi jumlah NaHS yang diperlukan untuk menyediakan larutan dengan kemolaran tertentu. Contohnya, kandungan NaHS dalam kajian kami ialah NaHS•1.3 H2O. Oleh itu, kepekatan NaHS sebenar dalam kajian ini mungkin lebih rendah daripada yang dilaporkan.
“Bagaimanakah sebatian yang berumur pendek sebegini boleh mempunyai kesan yang begitu lama?” Pozgay et al.21 menanyakan soalan ini semasa menilai kesan NaHS terhadap kolitis pada tikus. Mereka berharap kajian masa depan dapat menjawab soalan ini dan membuat spekulasi bahawa larutan NaHS mungkin mengandungi polisulfida yang lebih stabil selain H2S dan disulfida yang menjadi perantara kesan NaHS21. Satu lagi kemungkinan ialah kepekatan NaHS yang sangat rendah yang tinggal dalam larutan juga mungkin mempunyai kesan yang bermanfaat. Malah, Olson et al. memberikan bukti bahawa tahap mikromolar H2S dalam darah tidak bersifat fisiologi dan sepatutnya berada dalam julat nanomolar atau tiada langsung13. H2S mungkin bertindak melalui sulfasi protein, pengubahsuaian pasca-translasi yang boleh diterbalikkan yang mempengaruhi fungsi, kestabilan dan penyetempatan banyak protein52,53,54. Malah, di bawah keadaan fisiologi, kira-kira 10% hingga 25% daripada banyak protein hati disulfilasi53. Kedua-dua kajian mengakui kemusnahan NaHS19 yang cepat,23 tetapi secara mengejutkan menyatakan bahawa “kami mengawal kepekatan NaHS dalam air minuman dengan menggantikannya setiap hari.”23 Satu kajian secara tidak sengaja menyatakan bahawa “NaHS ialah penderma H2S standard dan biasanya digunakan dalam amalan klinikal untuk menggantikan H2S itu sendiri.”18
Perbincangan di atas menunjukkan bahawa NaHS hilang daripada larutan melalui pengewapan, pengoksidaan dan fotolisis, dan oleh itu beberapa cadangan dibuat untuk mengurangkan kehilangan H2S daripada larutan. Pertama, penyejatan H2S bergantung pada antara muka gas-cecair13 dan pH larutan11; oleh itu, untuk meminimumkan kehilangan penyejatan, leher botol air boleh dibuat sekecil mungkin seperti yang diterangkan sebelum ini15,19, dan pH air boleh diselaraskan kepada had atas yang boleh diterima (iaitu, 6.5–8.551) untuk meminimumkan kehilangan penyejatan11. Kedua, pengoksidaan spontan H2S berlaku disebabkan oleh kesan oksigen dan kehadiran ion logam peralihan dalam air minuman13, jadi penyahoksigenan air minuman dengan argon atau nitrogen44,45 dan penggunaan pengkelat logam37,47 boleh mengurangkan pengoksidaan sulfida. Ketiga, untuk mencegah fotodekomposisi H2S, botol air boleh dibalut dengan kerajang aluminium; Amalan ini juga terpakai kepada bahan sensitif cahaya seperti streptozotocin55. Akhir sekali, garam sulfida bukan organik (NaHS, Na2S, dan CaS) boleh diberikan melalui gavage dan bukannya dilarutkan dalam air minuman seperti yang dilaporkan sebelum ini56,57,58; kajian telah menunjukkan bahawa natrium sulfida radioaktif yang diberikan melalui gavage kepada tikus diserap dan diedarkan dengan baik ke hampir semua tisu59. Sehingga kini, kebanyakan kajian telah memberikan garam sulfida bukan organik secara intraperitoneal; walau bagaimanapun, laluan ini jarang digunakan dalam persekitaran klinikal60. Sebaliknya, laluan oral adalah laluan pemberian yang paling biasa dan diutamakan pada manusia61. Oleh itu, kami mengesyorkan untuk menilai kesan penderma H2S pada tikus melalui gavage oral.
Satu batasan ialah kami mengukur sulfida dalam larutan akueus dan serum menggunakan kaedah MB. Kaedah untuk mengukur sulfida termasuk titrasi iodin, spektrofotometri, kaedah elektrokimia (potensiometri, amperometri, kaedah koulometrik dan kaedah amperometrik) dan kromatografi (kromatografi gas dan kromatografi cecair berprestasi tinggi), antaranya kaedah yang paling biasa digunakan ialah kaedah spektrofotometri MB62. Satu batasan kaedah MB untuk mengukur H2S dalam sampel biologi ialah ia mengukur semua sebatian yang mengandungi sulfur dan bukan H2S63 bebas kerana ia dilakukan dalam keadaan berasid, yang menghasilkan pengekstrakan sulfur daripada sumber biologi64. Walau bagaimanapun, menurut Persatuan Kesihatan Awam Amerika, MB ialah kaedah standard untuk mengukur sulfida dalam air65. Oleh itu, batasan ini tidak menjejaskan keputusan utama kami mengenai ketidakstabilan larutan yang mengandungi NaHS. Tambahan pula, dalam kajian kami, pemulihan pengukuran sulfida dalam sampel air dan serum yang mengandungi NaHS masing-masing adalah 91% dan 93%. Nilai-nilai ini selaras dengan julat yang dilaporkan sebelum ini (77–92)66, menunjukkan ketepatan analitikal yang boleh diterima42. Perlu diingatkan bahawa kami menggunakan kedua-dua tikus jantan dan betina mengikut garis panduan Institut Kesihatan Kebangsaan (NIH) untuk mengelakkan terlalu bergantung pada kajian haiwan jantan sahaja dalam kajian praklinikal67 dan memasukkan kedua-dua tikus jantan dan betina apabila boleh68. Perkara ini telah ditekankan oleh orang lain69,70,71.
Kesimpulannya, hasil kajian ini menunjukkan bahawa larutan NaHS yang disediakan daripada air minuman tidak boleh digunakan untuk menghasilkan H2S kerana ketidakstabilannya. Kaedah pemberian ini akan mendedahkan haiwan kepada tahap NaHS yang tidak stabil dan lebih rendah daripada yang dijangkakan; oleh itu, penemuan ini mungkin tidak terpakai kepada manusia.
Set data yang digunakan dan/atau dianalisis semasa kajian semasa boleh didapati daripada penulis yang berkaitan atas permintaan yang munasabah.
Szabo, K. Garis masa penyelidikan hidrogen sulfida (H2S): daripada toksin persekitaran kepada pengantara biologi. Biokimia dan Farmakologi 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. dan Kimura, H. Kemungkinan peranan hidrogen sulfida sebagai neuromodulator endogen. Jurnal Neurosains, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. dan Papapetropoulos, A. Peranan fisiologi hidrogen sulfida dalam sel, tisu dan organ mamalia. Ulasan dalam Fisiologi dan Biologi Molekul 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, dan Kashfi, K. Janji yang berkembang bagi sistem penghantaran selular untuk nitrik oksida dan hidrogen sulfida: era baharu perubatan yang diperibadikan. Biokimia dan Farmakologi 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., dkk. Pemberian jangka panjang penderma hidrogen sulfida pelepasan perlahan boleh mencegah kecederaan iskemia/reperfusi miokardium. Laporan saintifik 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM dan Hermann, A. BK fosforilasi saluran mengawal selia kepekaan hidrogen sulfida (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM dan Hermann, A. Hidrogen sulfida meningkatkan aktiviti saluran kalium (BK) yang diaktifkan kalsium dalam sel tumor pituitari tikus. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., dkk. Hidrogen sulfida meningkatkan kesan perlindungan nitrit terhadap kecederaan iskemia-reperfusi miokardium pada tikus diabetes jenis 2. Nitrik Oksida 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., dkk. Trend dalam kimia penderma H2S dan kesannya terhadap penyakit kardiovaskular. Antioksidan 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, dan Olson, KR (2012). Kehilangan pasif hidrogen sulfida dalam eksperimen biologi. Biokimia Analitik 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., dkk. Aspek kimia pengukuran hidrogen sulfida dalam sampel fisiologi. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Penentuan spektrofotometri hidrogen sulfida dalam perairan semula jadi. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Latihan praktikal dalam kimia dan biologi hidrogen sulfida. “Antioksidan.” Isyarat Redoks. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).