Kami sebelum ini melaporkan bahawa tahap serum metabolit triptofan asid indole-3-propionik (IPA) yang berasal dari usus adalah lebih rendah pada pesakit dengan fibrosis hati. Dalam kajian ini, kami mengkaji transkriptom dan metilom DNA dalam hati obes berhubung kait dengan tahap IPA serum, serta peranan IPA dalam mendorong penyahaktifan fenotip sel stellat hepatik (HSC) secara in vitro.
Kajian ini melibatkan 116 pesakit obes tanpa diabetes mellitus jenis 2 (T2DM) (umur 46.8 ± 9.3 tahun; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) yang menjalani pembedahan bariatrik di Pusat Pembedahan Bariatrik Kuopio (KOBS). Tahap IPA yang beredar diukur melalui kromatografi cecair-spektrometri jisim (LC-MS), analisis transkriptom hati dilakukan melalui penjujukan RNA total, dan analisis metilasi DNA dilakukan menggunakan Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Sel stellata hepatik manusia (LX-2) digunakan untuk eksperimen in vitro.
Tahap IPA serum berkorelasi dengan ekspresi gen yang terlibat dalam laluan apoptosis, mitofagik dan umur panjang dalam hati. Gen AKT serina/treonina kinase 1 (AKT1) merupakan gen yang berinteraksi paling banyak dan dominan dalam transkrip hati dan profil metilasi DNA. Rawatan IPA mendorong apoptosis, mengurangkan respirasi mitokondria dan mengubah morfologi sel dan dinamik mitokondria dengan memodulasi ekspresi gen yang diketahui mengawal fibrosis, apoptosis dan kemandirian sel LX-2.
Secara keseluruhannya, data ini menyokong bahawa IPA mempunyai kesan terapeutik yang berpotensi dan boleh mendorong apoptosis dan mengalihkan fenotip HSC ke arah keadaan tidak aktif, sekali gus meluaskan kemungkinan menghalang fibrosis hati dengan mengganggu pengaktifan HSC dan metabolisme mitokondria.
Prevalens obesiti dan sindrom metabolik telah dikaitkan dengan peningkatan kejadian penyakit hati berlemak yang berkaitan dengan metabolik (MASLD); penyakit ini menjejaskan 25% hingga 30% daripada populasi umum [1]. Akibat utama etiologi MASLD ialah fibrosis hati, proses dinamik yang dicirikan oleh pengumpulan berterusan matriks ekstraselular berserat (ECM) [2]. Sel utama yang terlibat dalam fibrosis hati ialah sel stellata hepatik (HSC), yang mempamerkan empat fenotip yang diketahui: senyap, diaktifkan, dinyahaktifkan, dan penuaan [3, 4]. HSC boleh diaktifkan dan dibezakan secara trans daripada bentuk senyap kepada sel seperti fibroblas proliferatif dengan permintaan tenaga yang tinggi, dengan peningkatan ekspresi aktin otot licin α (α-SMA) dan kolagen jenis I (Col-I) [5, 6]. Semasa pembalikan fibrosis hati, HSC yang diaktifkan dihapuskan melalui apoptosis atau penyahaktifan. Proses-proses ini termasuk penurunan regulasi gen fibrogenik dan modulasi gen prosurvival (seperti laluan isyarat NF-κB dan PI3K/Akt) [7, 8], serta perubahan dalam dinamik dan fungsi mitokondria [9].
Tahap serum metabolit triptofan asid indole-3-propionik (IPA), yang dihasilkan dalam usus, didapati menurun dalam penyakit metabolik manusia termasuk MASLD [10–13]. IPA dikaitkan dengan pengambilan serat diet, dikenali dengan kesan antioksidan dan anti-radangnya, dan melemahkan fenotip steatohepatitis bukan alkohol (NASH) yang disebabkan oleh diet secara in vivo dan in vitro [11–14]. Beberapa bukti datang daripada kajian kami sebelum ini, yang menunjukkan bahawa tahap IPA serum adalah lebih rendah pada pesakit dengan fibrosis hati berbanding pesakit obes tanpa fibrosis hati dalam Kajian Pembedahan Bariatrik Kuopio (KOBS). Tambahan pula, kami menunjukkan bahawa rawatan IPA boleh mengurangkan ekspresi gen yang merupakan penanda klasik lekatan sel, penghijrahan sel dan pengaktifan sel stem hematopoietik dalam model sel stellata hepatik manusia (LX-2) dan merupakan metabolit hepatoprotektif yang berpotensi [15]. Walau bagaimanapun, masih belum jelas bagaimana IPA mendorong regresi fibrosis hati dengan mengaktifkan apoptosis HSC dan bioenergetik mitokondria.
Di sini, kami menunjukkan bahawa serum IPA dikaitkan dengan ekspresi gen yang diperkaya dalam apoptosis, mitofagi, dan laluan umur panjang dalam hati individu obes tetapi bukan diabetes jenis 2 (KOBS). Tambahan pula, kami mendapati bahawa IPA boleh mendorong pembersihan dan degradasi sel stem hematopoietik (HSC) yang diaktifkan melalui laluan penyahaktifan. Keputusan ini mendedahkan peranan baharu untuk IPA, menjadikannya sasaran terapeutik yang berpotensi untuk menggalakkan regresi fibrosis hati.
Satu kajian terdahulu dalam kohort KOBS menunjukkan bahawa pesakit dengan fibrosis hati mempunyai tahap IPA yang lebih rendah dalam peredaran darah berbanding pesakit tanpa fibrosis hati [15]. Untuk mengecualikan potensi kesan pengganggu diabetes jenis 2, kami merekrut 116 pesakit obes tanpa diabetes jenis 2 (purata umur ± SD: 46.8 ± 9.3 tahun; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Jadual 1) daripada kajian KOBS yang sedang dijalankan sebagai populasi kajian [16]. Semua peserta memberikan persetujuan bertulis dan protokol kajian telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Hospital Daerah Savo Utara selaras dengan Deklarasi Helsinki (54/2005, 104/2008 dan 27/2010).
Spesimen biopsi hati telah diperoleh semasa pembedahan bariatrik dan dinilai secara histologi oleh ahli patologi berpengalaman mengikut kriteria yang diterangkan sebelum ini [17, 18]. Kriteria penilaian diringkaskan dalam Jadual Tambahan S1 dan telah diterangkan sebelum ini [19].
Sampel serum puasa dianalisis melalui kromatografi cecair-spektrometri jisim tidak disasarkan (LC-MS) untuk analisis metabolomik (n = 116). Sampel dianalisis menggunakan sistem UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Jerman) seperti yang diterangkan sebelum ini19. Pengenalpastian alkohol isopropil (IPA) adalah berdasarkan masa pengekalan dan perbandingan spektrum MS/MS dengan piawaian tulen. Keamatan isyarat IPA (kawasan puncak) telah dipertimbangkan dalam semua analisis selanjutnya [20].
Penjujukan RNA seluruh hati telah dilakukan menggunakan Illumina HiSeq 2500 dan data telah diproses terlebih dahulu seperti yang diterangkan sebelum ini [19, 21, 22]. Kami menjalankan analisis ekspresi pembezaan yang disasarkan bagi transkrip yang mempengaruhi fungsi/biogenesis mitokondria menggunakan 1957 gen yang dipilih daripada pangkalan data MitoMiner 4.0 [23]. Analisis metilasi DNA hati telah dilakukan menggunakan Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) menggunakan metodologi yang sama seperti yang diterangkan sebelum ini [24, 25].
Sel stellata hepatik manusia (LX-2) telah disediakan oleh Prof. Stefano Romeo dan telah dikultur serta dikekalkan dalam medium DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Untuk memilih dos kerja IPA, sel LX-2 telah dirawat dengan kepekatan IPA yang berbeza (10 μM, 100 μM dan 1 mM; Sigma, 220027) dalam medium DMEM/F12 selama 24 jam. Tambahan pula, untuk mengkaji keupayaan IPA untuk menyahaktifkan HSC, sel LX-2 telah dirawat bersama dengan 5 ng/ml TGF-β1 (sistem R&D, 240-B-002/CF) dan 1 mM IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. Bagi kawalan kenderaan yang sepadan, 4 nM HCL yang mengandungi 0.1% BSA telah digunakan untuk rawatan TGF-β1 dan 0.05% DMSO telah digunakan untuk rawatan IPA, dan kedua-duanya digunakan bersama untuk rawatan kombinasi.
Apoptosis telah dinilai menggunakan Kit Pengesanan Apoptosis FITC Annexin V dengan 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, LX-2 (1 × 105 sel/telaga) telah dikultur semalaman dalam plat 12-telaga dan kemudian dirawat dengan pelbagai dos IPA atau IPA dan TGF-β1. Keesokan harinya, sel terapung dan sel yang melekat telah dikumpulkan, ditripsinasi, dibasuh dengan PBS, digantung semula dalam penimbal pengikat Annexin V, dan diinkubasi dengan FITC-Annexin V dan 7-AAD selama 15 minit.
Mitokondria dalam sel hidup telah diwarnakan untuk aktiviti oksidatif menggunakan Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Bagi ujian MTR, sel LX-2 telah diinkubasi pada ketumpatan yang sama dengan IPA dan TGF-β1. Selepas 24 jam, sel hidup telah ditripsinasi, dibasuh dengan PBS, dan kemudian diinkubasi dengan 100 μM MTR dalam medium bebas serum pada suhu 37 °C selama 20 minit seperti yang diterangkan sebelum ini [26]. Bagi analisis morfologi sel hidup, saiz sel dan kerumitan sitoplasma telah dianalisis masing-masing menggunakan parameter serakan hadapan (FSC) dan serakan sisi (SSC).
Semua data (30,000 peristiwa) diperoleh menggunakan NovoCyte Quanteon (Agilent) dan dianalisis menggunakan perisian NovoExpress® 1.4.1 atau FlowJo V.10.
Kadar penggunaan oksigen (OCR) dan kadar pengasidan ekstraselular (ECAR) diukur dalam masa nyata menggunakan Penganalisis Fluks Ekstraselular Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) yang dilengkapi dengan Tekanan Mito Sel Seahorse XF mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, 2 × 104 sel LX-2/telaga telah disemai ke dalam plat kultur sel XF96. Selepas pengeraman semalaman, sel telah dirawat dengan isopropanol (IPA) dan TGF-β1 (Kaedah Tambahan 1). Analisis data telah dilakukan menggunakan perisian Seahorse XF Wave, yang merangkumi Penjana Laporan Ujian Fenotip Tenaga Sel Seahorse XF. Daripada ini, Indeks Kesihatan Bioenergetik (BHI) telah dikira [27].
Jumlah RNA telah ditranskripsikan menjadi cDNA. Untuk kaedah tertentu, lihat rujukan [15]. Tahap mRNA protein berasid ribosom 60S manusia P0 (RPLP0) dan siklofilin A1 (PPIA) telah digunakan sebagai kawalan gen konstitutif. Sistem PCR Masa Nyata QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Belanda) telah digunakan dengan Kit Campuran Induk Lanjutan Pantas TaqMan™ (Applied Biosystems) atau Kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), dan lipatan ekspresi gen relatif dikira menggunakan parameter kitaran nilai Ct perbandingan (ΔΔCt) dan kaedah ∆∆Ct. Butiran primer disediakan dalam Jadual Tambahan S2 dan S3.
DNA nuklear (ncDNA) dan DNA mitokondria (mtDNA) telah diekstrak menggunakan kit darah dan tisu DNeasy (Qiagen) seperti yang diterangkan sebelum ini [28]. Jumlah relatif mtDNA dikira dengan mengira nisbah setiap kawasan mtDNA sasaran kepada purata geometri bagi tiga kawasan DNA nuklear (mtDNA/ncDNA), seperti yang diperincikan dalam Kaedah Tambahan 2. Butiran primer untuk mtDNA dan ncDNA disediakan dalam Jadual Tambahan S4.
Sel hidup telah diwarnakan dengan Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) untuk menggambarkan rangkaian mitokondria antara sel dan intrasel. Sel LX-2 (1 × 104 sel/perigi) telah dikultur pada slaid kaca dalam plat kultur berdasar kaca yang sepadan (Ibidi GmbH, Martinsried, Jerman). Selepas 24 jam, sel LX-2 hidup telah diinkubasi dengan 100 μM MTR selama 20 minit pada suhu 37 °C dan nukleus sel telah diwarnakan dengan DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) seperti yang diterangkan sebelum ini [29]. Rangkaian mitokondria telah divisualisasikan menggunakan mikroskop terbalik Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jerman) yang dilengkapi dengan modul confocal Zeiss LSM 800 pada suhu 37 °C dalam atmosfera lembap dengan 5% CO2 menggunakan objektif 63×NA 1.3. Kami memperoleh sepuluh imej siri-Z untuk setiap jenis sampel. Setiap siri-Z mengandungi 30 bahagian, setiap satu dengan ketebalan 9.86 μm. Bagi setiap sampel, imej sepuluh medan pandangan yang berbeza telah diperoleh menggunakan perisian ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jerman), dan analisis morfologi mitokondria telah dilakukan menggunakan perisian ImageJ (v1.54d) [30, 31] mengikut parameter yang diperincikan dalam Kaedah Tambahan 3.
Sel-sel telah difiksasi dengan 2% glutaraldehida dalam penimbal fosfat 0.1 M, diikuti dengan fiksasi dengan 1% larutan osmium tetroksida (Sigma Aldrich, MO, Amerika Syarikat), didehidrasi secara beransur-ansur dengan aseton (Merck, Darmstadt, Jerman), dan akhirnya dibenamkan dalam resin epoksi. Keratan ultranipis disediakan dan diwarnakan dengan 1% uranil asetat (Merck, Darmstadt, Jerman) dan 1% plumbum sitrat (Merck, Darmstadt, Jerman). Imej ultrastruktur diperoleh menggunakan mikroskop elektron penghantaran JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Jepun) pada voltan pecutan 80 kV.
Morfologi sel LX-2 yang dirawat dengan IPA selama 24 jam dianalisis dengan mikroskopi kontras fasa pada pembesaran 50x menggunakan mikroskop cahaya terbalik Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 dan AxioCam MRm, Jena, Jerman).
Data klinikal dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai atau median (julat antara kuartil: IQR). Analisis varians sehala (pembolehubah selanjar) atau ujian χ² (pembolehubah kategori) digunakan untuk membandingkan perbezaan antara tiga kumpulan kajian. Kadar positif palsu (FDR) digunakan untuk membetulkan ujian berganda, dan gen dengan FDR < 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Analisis korelasi Spearman digunakan untuk menghubungkan metilasi DNA CpG dengan keamatan isyarat IPA, dengan nilai p nominal (p < 0.05) dilaporkan.
Analisis laluan telah dijalankan menggunakan alat analisis set gen berasaskan web (WebGestalt) untuk 268 transkrip (nominal p < 0.01), 119 transkrip berkaitan mitokondria (nominal p < 0.05), dan 4350 CpG daripada 3093 transkrip hati yang dikaitkan dengan tahap IPA serum yang beredar. Alat Venny DB (versi 2.1.0) yang tersedia secara percuma telah digunakan untuk mencari gen yang bertindih, dan StringDB (versi 11.5) telah digunakan untuk menggambarkan interaksi protein-protein.
Bagi eksperimen LX-2, sampel telah diuji untuk kenormalan menggunakan ujian D'Agostino-Pearson. Data diperoleh daripada sekurang-kurangnya tiga replika biologi dan tertakluk kepada ANOVA sehala dengan ujian post hoc Bonferroni. Nilai-p kurang daripada 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Data dibentangkan sebagai min ± SD, dan bilangan eksperimen ditunjukkan dalam setiap rajah. Semua analisis dan graf telah dilakukan menggunakan perisian statistik GraphPad Prism 8 untuk Windows (GraphPad Software Inc., versi 8.4.3, San Diego, Amerika Syarikat).
Pertama, kami mengkaji perkaitan tahap IPA serum dengan transkrip hati, seluruh badan, dan mitokondria. Dalam profil transkrip keseluruhan, gen terkuat yang dikaitkan dengan tahap IPA serum ialah MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; protein kinase teraktif mitogen-teraktif protein kinase 3); dalam profil transkrip berkaitan mitokondria, gen berkaitan terkuat ialah AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serina/treonina kinase 1) (Fail Tambahan 1 dan Fail Tambahan 2).
Kemudian, kami menganalisis transkrip global (n = 268; p < 0.01) dan transkrip berkaitan mitokondria (n = 119; p < 0.05), akhirnya mengenal pasti apoptosis sebagai laluan kanonik yang paling ketara (p = 0.0089). Bagi transkrip mitokondria yang berkaitan dengan tahap IPA serum, kami menumpukan pada apoptosis (FDR = 0.00001), mitofagi (FDR = 0.00029), dan laluan isyarat TNF (FDR = 0.000006) (Rajah 1A, Jadual 2, dan Rajah Tambahan 1A-B).
Analisis pertindihan transkrip global yang berkaitan dengan mitokondria dan metilasi DNA dalam hati manusia yang berkaitan dengan tahap IPA serum. A mewakili 268 transkrip global, 119 transkrip yang berkaitan dengan mitokondria dan transkrip DNA termetilasi yang dipetakan ke 3092 tapak CpG yang berkaitan dengan tahap IPA serum (nilai p < 0.01 untuk transkrip global dan DNA termetilasi dan nilai p < 0.05 untuk transkrip mitokondria). Transkrip pertindihan utama ditunjukkan di tengah (AKT1 dan YKT6). B Peta interaksi 13 gen dengan skor interaksi tertinggi (0.900) dengan gen lain dibina daripada 56 gen yang bertindih (rantau garis hitam) yang dikaitkan secara signifikan dengan tahap IPA serum menggunakan alat dalam talian StringDB. Hijau: Gen dipetakan ke komponen selular Ontologi Gen (GO): mitokondria (GO:0005739). AKT1 ialah protein dengan skor tertinggi (0.900) untuk interaksi dengan protein lain berdasarkan data (berdasarkan perlombongan teks, eksperimen, pangkalan data dan ekspresi bersama). Nod rangkaian mewakili protein, dan tepi mewakili sambungan antara protein.
Oleh kerana metabolit mikrobiota usus boleh mengawal komposisi epigenetik melalui metilasi DNA [32], kami menyiasat sama ada tahap IPA serum dikaitkan dengan metilasi DNA hati. Kami mendapati bahawa dua tapak metilasi utama yang dikaitkan dengan tahap IPA serum adalah berhampiran kawasan kaya prolin-serina 3 (C19orf55) dan protein kejutan haba keluarga B (kecil) ahli 6 (HSPB6) (Fail tambahan 3). Metilasi DNA 4350 CpG (p < 0.01) berkorelasi dengan tahap IPA serum dan diperkaya dalam laluan pengawalseliaan jangka hayat (p = 0.006) (Rajah 1A, Jadual 2, dan Rajah Tambahan 1C).
Untuk memahami mekanisme biologi yang mendasari perkaitan antara tahap IPA serum, transkrip global, transkrip berkaitan mitokondria, dan metilasi DNA dalam hati manusia, kami menjalankan analisis pertindihan gen yang dikenal pasti dalam analisis laluan sebelumnya (Rajah 1A). Keputusan analisis pengayaan laluan bagi 56 gen yang bertindih (di dalam garisan hitam dalam Rajah 1A) menunjukkan bahawa laluan apoptosis (p = 0.00029) menonjolkan dua gen yang sama dengan tiga analisis: AKT1 dan YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), seperti yang ditunjukkan dalam gambar rajah Venn (Rajah Tambahan 2 dan Rajah 1A). Menariknya, kami mendapati bahawa AKT1 (cg19831386) dan YKT6 (cg24161647) berkorelasi positif dengan tahap IPA serum (Fail Tambahan 3). Untuk mengenal pasti interaksi protein yang berpotensi antara produk gen, kami memilih 13 gen dengan skor rantau sepunya tertinggi (0.900) antara 56 gen yang bertindih sebagai input dan membina peta interaksi. Mengikut tahap keyakinan (keyakinan marginal), gen AKT1 dengan skor tertinggi (0.900) berada di kedudukan teratas (Rajah 1B).
Berdasarkan analisis laluan, kami mendapati bahawa apoptosis adalah laluan utama, jadi kami menyiasat sama ada rawatan IPA akan mempengaruhi apoptosis HSC secara in vitro. Sebelum ini kami menunjukkan bahawa dos IPA yang berbeza (10 μM, 100 μM, dan 1 mM) adalah tidak toksik kepada sel LX-2 [15]. Kajian ini menunjukkan bahawa rawatan IPA pada 10 μM dan 100 μM meningkatkan bilangan sel yang berdaya maju dan nekrotik. Walau bagaimanapun, berbanding dengan kumpulan kawalan, daya maju sel menurun pada kepekatan IPA 1 mM, manakala kadar nekrosis sel kekal tidak berubah (Rajah 2A, B). Seterusnya, untuk mencari kepekatan optimum untuk mendorong apoptosis dalam sel LX-2, kami menguji 10 μM, 100 μM, dan 1 mM IPA selama 24 jam (Rajah 2A-E dan Rajah Tambahan 3A-B). Menariknya, IPA 10 μM dan 100 μM menurunkan kadar apoptosis (%), walau bagaimanapun, IPA 1 mM meningkatkan apoptosis lewat dan kadar apoptosis (%) berbanding kawalan dan oleh itu dipilih untuk eksperimen selanjutnya (Rajah 2A–D).
IPA mendorong apoptosis sel LX-2. Kaedah pewarnaan berganda Annexin V dan 7-AAD digunakan untuk mengukur kadar apoptosis dan morfologi sel melalui sitometri aliran. Sel BA diinkubasi dengan 10 μM, 100 μM dan 1 mM IPA selama 24 jam atau dengan F–H TGF-β1 (5 ng/ml) dan 1 mM IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. A: sel hidup (Annexin V -/ 7AAD-); B: sel nekrotik (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: awal (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: lewat (Annexin V+/7AAD.+); E, H: peratusan jumlah sel apoptosis awal dan lewat dalam kadar apoptosis (%). Data dinyatakan sebagai min ± SD, n = 3 eksperimen bebas. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA sehala dengan ujian post hoc Bonferroni. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Seperti yang telah kami tunjukkan sebelum ini, 5 ng/ml TGF-β1 boleh mendorong pengaktifan HSC dengan meningkatkan ekspresi gen penanda klasik [15]. Sel LX-2 dirawat dengan 5 ng/ml TGF-β1 dan 1 mM IPA secara gabungan (Rajah 2E–H). Rawatan TGF-β1 tidak mengubah kadar apoptosis, namun, rawatan bersama IPA meningkatkan kadar apoptosis dan apoptosis lewat (%) berbanding dengan rawatan TGF-β1 (Rajah 2E–H). Keputusan ini menunjukkan bahawa 1 mM IPA boleh menggalakkan apoptosis dalam sel LX-2 secara bebas daripada induksi TGF-β1.
Kami selanjutnya mengkaji kesan IPA terhadap respirasi mitokondria dalam sel LX-2. Keputusan menunjukkan bahawa 1 mM IPA mengurangkan parameter kadar penggunaan oksigen (OCR): respirasi bukan mitokondria, respirasi basal dan maksimal, kebocoran proton dan penghasilan ATP berbanding kumpulan kawalan (Rajah 3A, B), manakala indeks kesihatan bioenergetik (BHI) tidak berubah.
IPA mengurangkan respirasi mitokondria dalam sel LX-2. Lengkung respirasi mitokondria (OCR) dibentangkan sebagai parameter respirasi mitokondria (respirasi bukan mitokondria, respirasi basal, respirasi maksimum, kebocoran proton, penjanaan ATP, SRC dan BHI). Sel A dan B diinkubasi dengan 10 μM, 100 μM dan 1 mM IPA selama 24 jam. Sel C dan D diinkubasi dengan TGF-β1 (5 ng/ml) dan 1 mM IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. Semua pengukuran dinormalisasikan kepada kandungan DNA menggunakan kit CyQuant. BHI: indeks kesihatan bioenergetik; SRC: kapasiti rizab pernafasan; OCR: kadar penggunaan oksigen. Data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD), n = 5 eksperimen bebas. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA sehala dan ujian post hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; dan ***p < 0.001
Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih komprehensif tentang kesan IPA terhadap profil bioenergetik sel LX-2 yang diaktifkan oleh TGF-β1, kami menganalisis fosforilasi oksidatif mitokondria melalui OCR (Rajah 3C,D). Keputusan menunjukkan bahawa rawatan TGF-β1 dapat mengurangkan respirasi maksimum, kapasiti rizab pernafasan (SRC) dan BHI berbanding kumpulan kawalan (Rajah 3C,D). Di samping itu, rawatan kombinasi mengurangkan respirasi basal, kebocoran proton dan penghasilan ATP, tetapi SRC dan BHI adalah jauh lebih tinggi daripada yang dirawat dengan TGF-β1 (Rajah 3C,D).
Kami juga menjalankan "Ujian Fenotip Tenaga Selular" yang disediakan oleh perisian Seahorse (Rajah Tambahan 4A–D). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 3B, kedua-dua potensi metabolik OCR dan ECAR menurun selepas rawatan TGF-β1, walau bagaimanapun, tiada perbezaan yang diperhatikan dalam kumpulan rawatan kombinasi dan IPA berbanding kumpulan kawalan. Tambahan pula, kedua-dua tahap basal dan tekanan OCR menurun selepas rawatan kombinasi dan IPA berbanding kumpulan kawalan (Rajah Tambahan 4C). Menariknya, corak yang serupa diperhatikan dengan terapi kombinasi, di mana tiada perubahan dalam tahap basal dan tekanan ECAR diperhatikan berbanding rawatan TGF-β1 (Rajah Tambahan 4C). Dalam HSC, pengurangan fosforilasi oksidatif mitokondria dan keupayaan rawatan kombinasi untuk memulihkan SCR dan BHI selepas terdedah kepada rawatan TGF-β1 tidak mengubah potensi metabolik (OCR dan ECAR). Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa IPA boleh mengurangkan bioenergetik dalam HSC, menunjukkan bahawa IPA boleh mendorong profil bertenaga yang lebih rendah yang mengalihkan fenotip HSC ke arah penyahaktifan (Rajah Tambahan 4D).
Kesan IPA terhadap dinamik mitokondria telah dikaji menggunakan kuantifikasi tiga dimensi morfologi mitokondria dan sambungan rangkaian serta pewarnaan MTR (Rajah 4 dan Rajah Tambahan 5). Rajah 4 menunjukkan bahawa, berbanding dengan kumpulan kawalan, rawatan TGF-β1 mengurangkan purata luas permukaan, bilangan cabang, jumlah panjang cabang, dan bilangan simpang cabang (Rajah 4A dan B) dan mengubah perkadaran mitokondria daripada morfologi sfera kepada perantaraan (Rajah 4C). Hanya rawatan IPA yang mengurangkan purata isipadu mitokondria dan mengubah perkadaran mitokondria daripada morfologi sfera kepada perantaraan berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 4A). Sebaliknya, kesferaan, purata panjang cabang, dan aktiviti mitokondria yang dinilai oleh MTR yang bergantung kepada potensi membran mitokondria (Rajah 4A dan E) kekal tidak berubah dan parameter ini tidak berbeza antara kumpulan. Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan TGF-β1 dan IPA kelihatan memodulasi bentuk dan saiz mitokondria serta kerumitan rangkaian dalam sel LX-2 hidup.
IPA mengubah dinamik mitokondria dan kelimpahan DNA mitokondria dalam sel LX-2. A. Imej confocal perwakilan sel LX-2 hidup yang diinkubasi dengan TGF-β1 (5 ng/ml) dan 1 mM IPA selama 24 jam dalam medium bebas serum yang menunjukkan rangkaian mitokondria yang diwarnakan dengan Mitotracker™ Red CMXRos dan nukleus yang diwarnakan biru dengan DAPI. Semua data mengandungi sekurang-kurangnya 15 imej setiap kumpulan. Kami memperoleh 10 imej susunan-Z untuk setiap jenis sampel. Setiap jujukan paksi-Z mengandungi 30 hirisan, setiap satu dengan ketebalan 9.86 μm. Bar skala: 10 μm. B. Objek perwakilan (mitokondria sahaja) dikenal pasti dengan menggunakan ambang adaptif pada imej. Analisis kuantitatif dan perbandingan sambungan rangkaian morfologi mitokondria telah dilakukan untuk semua sel dalam setiap kumpulan. C. Kekerapan nisbah bentuk mitokondria. Nilai hampir 0 menunjukkan bentuk sfera, dan nilai hampir 1 menunjukkan bentuk filamen. D Kandungan DNA mitokondria (mtDNA) ditentukan seperti yang diterangkan dalam Bahan dan Kaedah. Analisis E Mitotracker™ Red CMXRos telah dijalankan melalui sitometri aliran (30,000 peristiwa) seperti yang diterangkan dalam Bahan dan Kaedah. Data dibentangkan sebagai min ± SD, n = 3 eksperimen bebas. Perbandingan statistik telah dijalankan menggunakan ANOVA sehala dan ujian post hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Kemudian, kami menganalisis kandungan mtDNA dalam sel LX-2 sebagai penunjuk bilangan mitokondria. Berbanding dengan kumpulan kawalan, kandungan mtDNA meningkat dalam kumpulan yang dirawat dengan TGF-β1 (Rajah 4D). Berbanding dengan kumpulan yang dirawat dengan TGF-β1, kandungan mtDNA menurun dalam kumpulan rawatan kombinasi (Rajah 4D), menunjukkan bahawa IPA boleh mengurangkan kandungan mtDNA dan mungkin bilangan mitokondria serta respirasi mitokondria (Rajah 3C). Selain itu, IPA nampaknya mengurangkan kandungan mtDNA dalam rawatan kombinasi tetapi tidak menjejaskan aktiviti mitokondria yang dimediasi MTR (Rajah 4A–C).
Kami mengkaji perkaitan IPA dengan tahap mRNA gen yang berkaitan dengan fibrosis, apoptosis, kemandirian, dan dinamik mitokondria dalam sel LX-2 (Rajah 5A–D). Berbanding dengan kumpulan kawalan, kumpulan yang dirawat dengan TGF-β1 menunjukkan peningkatan ekspresi gen seperti rantai α2 jenis kolagen I (COL1A2), aktin otot licin α (αSMA), matriks metalloproteinase 2 (MMP2), perencat tisu metalloproteinase 1 (TIMP1), dan gen seperti dinamin 1 (DRP1), yang menunjukkan peningkatan fibrosis dan pengaktifan. Tambahan pula, berbanding dengan kumpulan kawalan, rawatan TGF-β1 mengurangkan tahap mRNA reseptor pregnane X nuklear (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, perencat sel B α, penambah peptida cahaya gen faktor nuklear κ (NFκB1A), dan perencat subunit kinase faktor nuklear κB β (IKBKB) (Rajah 5A–D). Berbanding dengan rawatan TGF-β1, rawatan kombinasi dengan TGF-β1 dan IPA mengurangkan ekspresi COL1A2 dan MMP2, tetapi meningkatkan tahap mRNA PXR, TIMP1, limfoma sel-B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, dan IKBKB. Rawatan IPA mengurangkan ekspresi MMP2, protein berkaitan Bcl-2 X (BAX), AKT1, protein atrofi optik 1 (OPA1), dan protein gabungan mitokondria 2 (MFN2) dengan ketara, manakala ekspresi CASP8, NFκB1A, NFκB1B, dan IKBKB meningkat berbanding kumpulan kawalan. Walau bagaimanapun, tiada perbezaan ditemui dalam ekspresi caspase-3 (CASP3), faktor pengaktif peptidase apoptotik 1 (APAF1), protein gabungan mitokondria 1 (MFN1), dan protein pembelahan 1 (FIS1). Secara kolektif, keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan IPA memodulasi ekspresi gen yang berkaitan dengan fibrosis, apoptosis, kemandirian, dan dinamik mitokondria. Data kami menunjukkan bahawa rawatan IPA mengurangkan fibrosis dalam sel LX-2; pada masa yang sama, ia merangsang kemandirian dengan mengalihkan fenotip ke arah penyahaktifan.
IPA memodulasi ekspresi gen fibroblas, apoptosis, daya maju dan dinamik mitokondria dalam sel LX-2. Histogram memaparkan ekspresi mRNA relatif kepada kawalan endogen (RPLP0 atau PPIA) selepas sel LX-2 diinduksi dengan TGF-β1 dan IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. A menunjukkan fibroblas, B menunjukkan sel apoptosis, C menunjukkan sel yang masih hidup dan D menunjukkan ekspresi gen dinamik mitokondria. Data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD), n = 3 eksperimen bebas. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA sehala dan ujian post hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Kemudian, perubahan saiz sel (FSC-H) dan kerumitan sitoplasma (SSC-H) dinilai melalui sitometri aliran (Rajah 6A,B), dan perubahan morfologi sel selepas rawatan IPA dinilai melalui mikroskop elektron penghantaran (TEM) dan mikroskopi kontras fasa (Rajah Tambahan 6A-B). Seperti yang dijangkakan, sel dalam kumpulan yang dirawat TGF-β1 meningkat saiznya berbanding kumpulan kawalan (Rajah 6A,B), menunjukkan pengembangan klasik retikulum endoplasma kasar (ER*) dan fagolisosom (P), menunjukkan pengaktifan sel stem hematopoietik (HSC) (Rajah Tambahan 6A). Walau bagaimanapun, berbanding dengan kumpulan yang dirawat TGF-β1, saiz sel, kerumitan sitoplasma (Rajah 6A,B), dan kandungan ER* menurun dalam kumpulan rawatan kombinasi TGF-β1 dan IPA (Rajah Tambahan 6A). Tambahan pula, rawatan IPA mengurangkan saiz sel, kerumitan sitoplasma (Rajah 6A,B), kandungan P dan ER* (Rajah Tambahan 6A) berbanding dengan kumpulan kawalan. Di samping itu, kandungan sel apoptosis meningkat selepas 24 jam rawatan IPA berbanding dengan kumpulan kawalan (anak panah putih, Rajah Tambahan 6B). Secara kolektif, keputusan ini menunjukkan bahawa 1 mM IPA boleh merangsang apoptosis HSC dan membalikkan perubahan dalam parameter morfologi sel yang disebabkan oleh TGF-β1, sekali gus mengawal selia saiz dan kerumitan sel, yang mungkin dikaitkan dengan penyahaktifan HSC.
IPA mengubah saiz sel dan kerumitan sitoplasma dalam sel LX-2. Imej perwakilan analisis sitometri aliran. Analisis ini menggunakan strategi gating khusus untuk sel LX-2: SSC-A/FSC-A untuk menentukan populasi sel, FSC-H/FSC-A untuk mengenal pasti doublet, dan SSC-H/FSC-H untuk analisis saiz dan kerumitan sel. Sel diinkubasi dengan TGF-β1 (5 ng/ml) dan 1 mM IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. Sel LX-2 diagihkan ke kuadran kiri bawah (SSC-H-/FSC-H-), kuadran kiri atas (SSC-H+/FSC-H-), kuadran kanan bawah (SSC-H-/FSC-H+), dan kuadran kanan atas (SSC-H+/FSC-H+) untuk analisis saiz sel dan kerumitan sitoplasma. B. Morfologi sel dianalisis melalui sitometri aliran menggunakan FSC-H (serakan ke hadapan, saiz sel) dan SSC-H (serakan sisi, kerumitan sitoplasma) (30,000 peristiwa). Data dibentangkan sebagai min ± SD, n = 3 eksperimen bebas. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA sehala dan ujian post hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 dan ****p < 0.0001
Metabolit usus seperti IPA telah menjadi topik hangat penyelidikan, menunjukkan bahawa sasaran baharu mungkin ditemui dalam mikrobiota usus. Oleh itu, adalah menarik bahawa IPA, metabolit yang telah kami kaitkan dengan fibrosis hati pada manusia [15], telah terbukti sebagai sebatian anti-fibrotik yang berpotensi dalam model haiwan [13, 14]. Di sini, kami menunjukkan buat kali pertama hubungan antara serum IPA dan transkriptomik hati global dan metilasi DNA pada individu obes tanpa diabetes jenis 2 (T2D), yang menonjolkan apoptosis, mitofagi dan umur panjang, serta kemungkinan gen calon AKT1 yang mengawal selia homeostasis hati. Satu lagi perkara baharu dalam kajian kami ialah kami menunjukkan interaksi rawatan IPA dengan apoptosis, morfologi sel, bioenergetik mitokondria dan dinamik dalam sel LX-2, menunjukkan spektrum tenaga yang lebih rendah yang mengalihkan fenotip HSC ke arah penyahaktifan, menjadikan IPA calon yang berpotensi untuk meningkatkan fibrosis hati.
Kami mendapati bahawa apoptosis, mitofagi dan umur panjang merupakan laluan kanonik yang paling penting yang diperkaya dalam gen hati yang berkaitan dengan IPA serum yang beredar. Gangguan sistem kawalan kualiti mitokondria (MQC) boleh menyebabkan disfungsi mitokondria, mitofagi dan apoptosis, sekali gus menggalakkan berlakunya MASLD[33, 34]. Oleh itu, kita boleh membuat spekulasi bahawa IPA mungkin terlibat dalam mengekalkan dinamik sel dan integriti mitokondria melalui apoptosis, mitofagi dan umur panjang dalam hati. Data kami menunjukkan bahawa dua gen adalah biasa merentasi tiga ujian: YKT6 dan AKT1. Perlu diingatkan bahawa YKT6 ialah protein SNARE yang terlibat dalam proses gabungan membran sel. Ia memainkan peranan dalam autofagi dan mitofagi dengan membentuk kompleks permulaan dengan STX17 dan SNAP29 pada autofagosom, sekali gus menggalakkan gabungan autofagosom dan lisosom[35]. Tambahan pula, kehilangan fungsi YKT6 mengakibatkan mitofagi terjejas[36], manakala peningkatan regulasi YKT6 dikaitkan dengan perkembangan karsinoma hepatoselular (HCC), menunjukkan peningkatan kelangsungan hidup sel[37]. Sebaliknya, AKT1 merupakan gen yang berinteraksi paling penting dan memainkan peranan penting dalam penyakit hati, termasuk laluan isyarat PI3K/AKT, kitaran sel, migrasi sel, percambahan, lekatan fokus, fungsi mitokondria dan rembesan kolagen[38–40]. Laluan isyarat PI3K/AKT yang diaktifkan boleh mengaktifkan sel stem hematopoietik (HSC), yang merupakan sel yang bertanggungjawab untuk penghasilan matriks ekstraselular (ECM), dan disregulasinya boleh menyumbang kepada kejadian dan perkembangan fibrosis hati[40]. Di samping itu, AKT merupakan salah satu faktor utama kelangsungan hidup sel yang menghalang apoptosis sel yang bergantung kepada p53, dan pengaktifan AKT mungkin dikaitkan dengan perencatan apoptosis sel hati[41, 42]. Keputusan yang diperoleh menunjukkan bahawa IPA mungkin terlibat dalam apoptosis berkaitan mitokondria hati dengan mempengaruhi keputusan hepatosit antara memasuki apoptosis atau kelangsungan hidup. Kesan ini mungkin dikawal oleh gen calon AKT dan/atau YKT6, yang penting untuk homeostasis hati.
Keputusan kami menunjukkan bahawa 1 mM IPA mendorong apoptosis dan mengurangkan respirasi mitokondria dalam sel LX-2 tanpa mengira rawatan TGF-β1. Perlu diperhatikan bahawa apoptosis merupakan laluan utama untuk penyelesaian fibrosis dan pengaktifan sel stem hematopoietik (HSC), dan juga merupakan peristiwa penting dalam tindak balas fisiologi fibrosis hati yang boleh diterbalikkan [4, 43]. Selain itu, pemulihan BHI dalam sel LX-2 selepas rawatan kombinasi memberikan pandangan baharu tentang potensi peranan IPA dalam pengawalaturan bioenergetik mitokondria. Di bawah keadaan rehat dan tidak aktif, sel hematopoietik biasanya menggunakan fosforilasi oksidatif mitokondria untuk menghasilkan ATP dan mempunyai aktiviti metabolik yang rendah. Sebaliknya, pengaktifan HSC meningkatkan respirasi dan biosintesis mitokondria untuk mengimbangi permintaan tenaga memasuki keadaan glikolitik [44]. Hakikat bahawa IPA tidak menjejaskan potensi metabolik dan ECAR menunjukkan bahawa laluan glikolitik kurang diutamakan. Begitu juga, satu lagi kajian menunjukkan bahawa 1 mM IPA dapat memodulasi aktiviti rantai pernafasan mitokondria dalam kardiomiosit, sel hepatosit manusia (Huh7) dan sel endotel vena umbilik manusia (HUVEC); Walau bagaimanapun, tiada kesan IPA ditemui pada glikolisis dalam kardiomiosit, menunjukkan bahawa IPA boleh menjejaskan bioenergetik jenis sel lain [45]. Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa 1 mM IPA mungkin bertindak sebagai penyahganding kimia ringan, kerana ia boleh mengurangkan ekspresi gen fibrogenik, morfologi sel dan bioenergetik mitokondria dengan ketara tanpa mengubah jumlah mtDNA [46]. Penyahganding mitokondria boleh menghalang fibrosis yang disebabkan oleh kultur dan pengaktifan HSC [47] dan mengurangkan penghasilan ATP mitokondria yang dikawal selia atau diinduksi oleh protein tertentu seperti protein penyahganding (UCP) atau adenina nukleotida translokase (ANT). Bergantung pada jenis sel, fenomena ini boleh melindungi sel daripada apoptosis dan/atau menggalakkan apoptosis [46]. Walau bagaimanapun, kajian lanjut diperlukan untuk menjelaskan peranan IPA sebagai penyahganding mitokondria dalam penyahaktifan sel stem hematopoietik.
Kami kemudian menyiasat sama ada perubahan dalam respirasi mitokondria tercermin dalam morfologi mitokondria dalam sel LX-2 hidup. Menariknya, rawatan TGF-β1 mengubah perkadaran mitokondria daripada sfera kepada pertengahan, dengan penurunan percabangan mitokondria dan peningkatan ekspresi DRP1, faktor utama dalam pembelahan mitokondria [48]. Tambahan pula, pemecahan mitokondria dikaitkan dengan kerumitan rangkaian keseluruhan, dan peralihan daripada gabungan kepada pembelahan adalah penting untuk pengaktifan sel stem hematopoietik (HSC), manakala perencatan pembelahan mitokondria membawa kepada apoptosis HSC [49]. Oleh itu, keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan TGF-β1 boleh mendorong penurunan kerumitan rangkaian mitokondria dengan penurunan percabangan, yang lebih biasa dalam pembelahan mitokondria yang berkaitan dengan sel stem hematopoietik (HSC) yang diaktifkan. Tambahan pula, data kami menunjukkan bahawa IPA boleh mengubah perkadaran mitokondria daripada bentuk sfera kepada pertengahan, sekali gus mengurangkan ekspresi OPA1 dan MFN2. Kajian telah menunjukkan bahawa penurunan regulasi OPA1 boleh menyebabkan penurunan potensi membran mitokondria dan mencetuskan apoptosis sel[50]. MFN2 diketahui menjadi perantara pelakuran mitokondria dan apoptosis[51]. Keputusan yang diperoleh menunjukkan bahawa induksi sel LX-2 oleh TGF-β1 dan/atau IPA nampaknya memodulasi bentuk dan saiz mitokondria, serta keadaan pengaktifan dan kerumitan rangkaian.
Keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan gabungan TGFβ-1 dan IPA dapat mengurangkan mtDNA dan parameter morfologi sel dengan mengawal selia ekspresi mRNA fibrosis, apoptosis dan gen berkaitan survival dalam sel yang mengelak apoptosis. Sesungguhnya, IPA menurunkan tahap ekspresi mRNA AKT1 dan gen fibrosis penting seperti COL1A2 dan MMP2, tetapi meningkatkan tahap ekspresi CASP8, yang dikaitkan dengan apoptosis. Keputusan kami menunjukkan bahawa selepas rawatan IPA, ekspresi BAX menurun dan ekspresi mRNA subunit keluarga TIMP1, BCL-2 dan NF-κB meningkat, menunjukkan bahawa IPA dapat merangsang isyarat survival dalam sel stem hematopoietik (HSC) yang mengelak apoptosis. Molekul-molekul ini mungkin bertindak sebagai isyarat pro-survival dalam sel stem hematopoietik yang diaktifkan, yang mungkin dikaitkan dengan peningkatan ekspresi protein anti-apoptosis (seperti Bcl-2), penurunan ekspresi BAX pro-apoptosis, dan interaksi kompleks antara TIMP dan NF-κB [5, 7]. IPA memberikan kesannya melalui PXR, dan kami mendapati bahawa rawatan kombinasi dengan TGF-β1 dan IPA meningkatkan tahap ekspresi mRNA PXR, menunjukkan penindasan pengaktifan HSC. Isyarat PXR yang diaktifkan diketahui menghalang pengaktifan HSC secara in vivo dan in vitro [52, 53]. Keputusan kami menunjukkan bahawa IPA mungkin terlibat dalam pembersihan HSC yang diaktifkan dengan menggalakkan apoptosis, mengurangkan metabolisme fibrosis dan mitokondria, dan meningkatkan isyarat survival, yang merupakan proses tipikal yang menukar fenotip HSC yang diaktifkan kepada yang tidak diaktifkan. Satu lagi penjelasan yang mungkin untuk mekanisme dan peranan IPA yang berpotensi dalam apoptosis ialah ia membersihkan mitokondria yang tidak berfungsi terutamanya melalui mitofagi (laluan intrinsik) dan laluan isyarat TNF ekstrinsik (Jadual 1), yang dikaitkan secara langsung dengan laluan isyarat survival NF-κB (Rajah Tambahan 7). Menariknya, gen yang diperkaya berkaitan IPA mampu mendorong isyarat pro-apoptosis dan pro-survival dalam laluan apoptosis [54], menunjukkan bahawa IPA boleh mendorong laluan apoptosis atau survival dengan berinteraksi dengan gen ini. Walau bagaimanapun, bagaimana IPA mendorong apoptosis atau survival semasa pengaktifan HSC dan laluan mekanistiknya masih tidak jelas.
IPA ialah metabolit mikrob yang terbentuk daripada triptofan diet melalui mikrobiota usus. Kajian telah menunjukkan bahawa ia mempunyai ciri-ciri pengawalseliaan anti-radang, antioksidan dan epigenetik dalam persekitaran usus.[55] Kajian telah menunjukkan bahawa IPA boleh memodulasi fungsi penghalang usus dan mengurangkan tekanan oksidatif, yang mungkin menyumbang kepada kesan fisiologi tempatannya.[56] Malah, IPA diangkut ke organ sasaran melalui peredaran, dan memandangkan IPA berkongsi struktur metabolit utama yang serupa dengan triptofan, serotonin dan derivatif indol, IPA melakukan tindakan metabolik yang mengakibatkan nasib metabolik yang kompetitif.[52] IPA mungkin bersaing dengan metabolit yang berasal dari triptofan untuk tapak pengikatan pada enzim atau reseptor, yang berpotensi mengganggu laluan metabolik normal. Ini menonjolkan keperluan untuk kajian lanjut mengenai farmakokinetik dan farmakodinamiknya untuk lebih memahami tetingkap terapeutiknya.[57] Masih belum dapat dilihat sama ada ini juga boleh berlaku dalam sel stem hematopoietik (HSC).
Kami mengakui bahawa kajian kami mempunyai beberapa batasan. Untuk mengkaji secara khusus kaitan yang berkaitan dengan IPA, kami mengecualikan pesakit diabetes mellitus jenis 2 (T2DM). Kami mengakui bahawa ini mengehadkan kebolehgunaan luas penemuan kami kepada pesakit diabetes mellitus jenis 2 dan penyakit hati peringkat lanjut. Walaupun kepekatan fisiologi IPA dalam serum manusia adalah 1–10 μM [11, 20], kepekatan 1 mM IPA dipilih berdasarkan kepekatan bukan toksik tertinggi [15] dan kadar apoptosis tertinggi, tanpa perbezaan dalam peratusan populasi sel nekrotik. Walaupun tahap suprafisiologi IPA digunakan dalam kajian ini, pada masa ini tiada konsensus mengenai dos berkesan IPA [52]. Walaupun keputusan kami signifikan, nasib metabolik IPA yang lebih luas kekal sebagai bidang penyelidikan yang aktif. Selain itu, penemuan kami tentang kaitan antara tahap serum IPA dan metilasi DNA transkrip hati diperoleh bukan sahaja daripada sel stem hematopoietik (HSC) tetapi juga daripada tisu hati. Kami memilih untuk menggunakan sel LX-2 manusia berdasarkan penemuan terdahulu kami daripada analisis transkriptom bahawa IPA dikaitkan dengan pengaktifan sel stem hematopoietik (HSC) [15], dan HSC adalah sel utama yang terlibat dalam perkembangan fibrosis hati. Hati terdiri daripada pelbagai jenis sel, jadi model sel lain seperti sistem kultur bersama sel imun hepatosit-HSC yang digabungkan dengan pengaktifan kaspase dan pemecahan DNA serta mekanisme tindakan termasuk tahap protein harus dipertimbangkan untuk mengkaji peranan IPA dan interaksinya dengan jenis sel hati yang lain.