Teori pertahanan tumbuhan yang berbeza memberikan panduan teori yang penting untuk menjelaskan corak metabolisme khusus tumbuhan, tetapi ramalan utama mereka masih perlu diuji. Di sini, kami menggunakan analisis spektrometri jisim tandem (MS/MS) yang tidak berat sebelah untuk meneroka secara sistematik metabolit strain tembakau yang dilemahkan daripada tumbuhan individu kepada populasi dan spesies yang berkait rapat, dan memproses sebilangan besar teori ciri spektrometri jisim berdasarkan spektrum sebatian dalam maklumat. Kerangka kerja untuk menguji ramalan utama teori pertahanan optimum (OD) dan sasaran bergerak (MT). Komponen maklumat metabolomik tumbuhan adalah selaras dengan teori OD, tetapi bercanggah dengan ramalan utama teori MT mengenai dinamik metabolomik yang disebabkan oleh herbivor. Daripada skala evolusi mikro hingga makro, isyarat jasmonat dikenal pasti sebagai penentu utama OD, manakala isyarat etilena memberikan penalaan halus tindak balas khusus herbivor yang dijelaskan oleh rangkaian molekul MS/MS.
Metabolit khas dengan pelbagai struktur merupakan peserta utama dalam penyesuaian tumbuhan terhadap persekitaran, terutamanya dalam pertahanan musuh (1). Kepelbagaian metabolisme khas yang menakjubkan yang terdapat dalam tumbuhan telah merangsang penyelidikan mendalam selama beberapa dekad mengenai pelbagai aspek fungsi ekologinya, dan telah membentuk senarai panjang teori pertahanan tumbuhan, iaitu perkembangan evolusi dan ekologi interaksi tumbuhan-serangga. Penyelidikan empirikal memberikan panduan penting (2). Walau bagaimanapun, teori pertahanan tumbuhan ini tidak mengikuti laluan normatif penaakulan deduktif hipotetikal, di mana ramalan utama berada pada tahap analisis yang sama (3) dan diuji secara eksperimen untuk memajukan kitaran perkembangan teori seterusnya (4). Batasan teknikal mengehadkan pengumpulan data kepada kategori metabolik tertentu dan mengecualikan analisis komprehensif metabolit khusus, sekali gus menghalang perbandingan antara kategori yang penting untuk pembangunan teori (5). Kekurangan data metabolomik yang komprehensif dan mata wang yang sama untuk membandingkan aliran kerja pemprosesan ruang metabolik antara kumpulan tumbuhan yang berbeza menghalang kematangan saintifik bidang ini.
Perkembangan terkini dalam bidang metabolomik spektrometri jisim tandem (MS/MS) boleh mencirikan perubahan metabolik secara komprehensif dalam dan antara spesies klad sistem tertentu, dan boleh digabungkan dengan kaedah pengiraan untuk mengira persamaan struktur antara campuran kompleks ini. Pengetahuan kimia terdahulu (5). Gabungan teknologi canggih dalam analisis dan pengkomputeran menyediakan rangka kerja yang diperlukan untuk ujian jangka panjang bagi banyak ramalan yang dibuat oleh teori ekologi dan evolusi kepelbagaian metabolik. Shannon (6) memperkenalkan teori maklumat buat kali pertama dalam artikel pentingnya pada tahun 1948, meletakkan asas untuk analisis matematik maklumat, yang telah digunakan dalam banyak bidang selain daripada aplikasi asalnya. Dalam genomik, teori maklumat telah berjaya digunakan untuk mengukur maklumat konservatif jujukan (7). Dalam penyelidikan transkriptomik, teori maklumat menganalisis perubahan keseluruhan dalam transkriptom (8). Dalam penyelidikan terdahulu, kami menggunakan rangka kerja statistik teori maklumat kepada metabolomik untuk menggambarkan kepakaran metabolik tahap tisu dalam tumbuhan (9). Di sini, kami menggabungkan aliran kerja berasaskan MS/MS dengan kerangka statistik teori maklumat, yang dicirikan oleh kepelbagaian metabolik dalam mata wang biasa, untuk membandingkan ramalan utama teori pertahanan tumbuhan bagi metabolit yang disebabkan oleh herbivor.
Kerangka teori pertahanan tumbuhan biasanya saling inklusif dan boleh dibahagikan kepada dua kategori: yang cuba menjelaskan taburan metabolit khusus tumbuhan berdasarkan fungsi pertahanan, seperti pertahanan optimum (OD) (10), sasaran bergerak (MT) (11)) Dan teori penampilan (12), sementara yang lain mencari penjelasan mekanikal tentang bagaimana perubahan ketersediaan sumber mempengaruhi pertumbuhan tumbuhan dan pengumpulan metabolit khusus, seperti karbon: hipotesis keseimbangan nutrien (13), hipotesis kadar pertumbuhan (14), dan hipotesis keseimbangan pertumbuhan dan pembezaan (15). Kedua-dua set teori berada pada tahap analisis yang berbeza (4). Walau bagaimanapun, dua teori yang melibatkan fungsi pertahanan pada tahap fungsi mendominasi perbualan tentang pertahanan konstitutif dan boleh diinduksi tumbuhan: teori OD, yang menganggap bahawa tumbuhan melabur dalam pertahanan kimia mereka yang mahal hanya apabila diperlukan, contohnya, apabila ia ditelan. Oleh itu, apabila haiwan rumput menyerang, mengikut kemungkinan serangan masa hadapan, sebatian dengan fungsi pertahanan diberikan (10); Hipotesis MT mencadangkan bahawa tiada paksi perubahan metabolit berarah, tetapi metabolit berubah secara rawak, sekali gus mewujudkan kemungkinan Menghalang "sasaran gerakan" metabolik herbivor yang menyerang. Dalam erti kata lain, kedua-dua teori ini membuat ramalan yang bertentangan tentang pembentukan semula metabolik yang berlaku selepas serangan herbivor: hubungan antara pengumpulan metabolit searah dengan fungsi pertahanan (OD) dan perubahan metabolik tidak terarah (MT) (11).
Hipotesis OD dan MT bukan sahaja melibatkan perubahan teraruh dalam metabolit, tetapi juga akibat ekologi dan evolusi daripada pengumpulan metabolit ini, seperti kos penyesuaian dan faedah perubahan metabolik ini dalam persekitaran ekologi tertentu (16). Walaupun kedua-dua hipotesis mengiktiraf fungsi pertahanan metabolit khusus, yang mungkin atau mungkin tidak mahal, ramalan utama yang membezakan hipotesis OD dan MT terletak pada arah perubahan metabolik yang teraruh. Ramalan teori OD telah menerima perhatian eksperimen paling banyak setakat ini. Ujian ini merangkumi kajian fungsi pertahanan langsung atau tidak langsung tisu yang berbeza bagi sebatian tertentu di rumah hijau dan keadaan semula jadi, serta perubahan dalam peringkat perkembangan tumbuhan (17-19). Walau bagaimanapun, setakat ini, disebabkan kekurangan aliran kerja dan rangka kerja statistik untuk analisis komprehensif global tentang kepelbagaian metabolik mana-mana organisma, ramalan perbezaan utama antara kedua-dua teori (iaitu, arah perubahan metabolik) masih perlu diuji. Di sini, kami menyediakan analisis sedemikian.
Salah satu ciri metabolit khusus tumbuhan yang paling ketara ialah kepelbagaian strukturnya yang ekstrem di semua peringkat daripada tumbuhan tunggal, populasi hingga spesies yang serupa (20). Banyak perubahan kuantitatif dalam metabolit khusus boleh diperhatikan pada skala populasi, manakala perbezaan kualitatif yang kuat biasanya dikekalkan pada peringkat spesies (20). Oleh itu, kepelbagaian metabolik tumbuhan adalah aspek utama kepelbagaian fungsian, yang mencerminkan kebolehsuaian kepada niche yang berbeza, terutamanya niche yang mempunyai kemungkinan pencerobohan yang berbeza oleh serangga khas dan herbivor biasa (21). Sejak artikel inovatif Fraenkel (22) tentang sebab-sebab kewujudan metabolit khusus tumbuhan, interaksi dengan pelbagai serangga telah dianggap sebagai tekanan pemilihan yang penting, dan interaksi ini dipercayai telah membentuk tumbuhan semasa evolusi. Laluan metabolik (23). Perbezaan antara spesies dalam kepelbagaian metabolit khusus juga boleh mencerminkan keseimbangan fisiologi yang berkaitan dengan pertahanan tumbuhan konstitutif dan boleh diinduksi terhadap strategi herbivor, kerana kedua-dua spesies sering berkorelasi negatif antara satu sama lain (24). Walaupun mungkin bermanfaat untuk mengekalkan pertahanan yang baik sepanjang masa, perubahan metabolik yang tepat pada masanya yang berkaitan dengan pertahanan memberikan manfaat yang jelas dalam membolehkan tumbuhan memperuntukkan sumber berharga kepada pelaburan fisiologi lain (19, 24), dan mengelakkan keperluan untuk simbiosis. Kerosakan cagaran (25). Di samping itu, penyusunan semula metabolit khusus yang disebabkan oleh herbivor serangga ini boleh menyebabkan taburan yang merosakkan dalam populasi (26), dan mungkin mencerminkan bacaan langsung perubahan semula jadi yang ketara dalam isyarat asid jasmonik (JA), yang mungkin dikekalkan dalam populasi. Isyarat JA yang tinggi dan rendah adalah pertukaran antara pertahanan terhadap herbivor dan persaingan dengan spesies tertentu (27). Di samping itu, laluan biosintetik metabolit khusus akan mengalami kehilangan dan transformasi yang cepat semasa evolusi, mengakibatkan taburan metabolik yang tidak rata antara spesies yang berkait rapat (28). Polimorfisme ini boleh diwujudkan dengan cepat sebagai tindak balas kepada perubahan corak herbivor (29), yang bermaksud bahawa turun naik komuniti herbivor adalah faktor utama yang mendorong heterogeniti metabolik.
Di sini, kami secara khusus menyelesaikan masalah berikut. (I) Bagaimanakah serangga herbivor mengkonfigurasi semula metabolit tumbuhan? (Ii) Apakah komponen maklumat utama keplastikan metabolik yang boleh diukur untuk menguji ramalan teori pertahanan jangka panjang? (Iii) Sama ada untuk memprogram semula metabolit tumbuhan dengan cara yang unik kepada penyerang, jika ya, apakah peranan yang dimainkan oleh hormon tumbuhan dalam menyesuaikan tindak balas metabolik tertentu, dan metabolit yang manakah menyumbang kepada kekhususan spesies pertahanan? (Iv) Memandangkan ramalan yang dibuat oleh banyak teori pertahanan boleh diperluaskan merentasi semua peringkat tisu biologi, kami bertanya sejauh mana konsisten tindak balas metabolik yang disebabkan daripada perbandingan dalaman kepada perbandingan antara spesies? Untuk tujuan ini, kami telah mengkaji secara sistematik metabolit daun nikotin tembakau, yang merupakan tumbuhan model ekologi dengan metabolisme khusus yang kaya, dan berkesan terhadap larva dua herbivor asli, Lepidoptera Datura (Ms) (Sangat agresif, kebanyakannya dimakan). Pada Solanaceae dan Spodoptera littoralis (Sl), cacing daun kapas adalah sejenis "genus", dengan tumbuhan perumah Solanaceae dan perumah lain daripada genera dan keluarga lain Makanan tumbuhan. Kami menghuraikan spektrum metabolomik MS/MS dan mengekstrak deskriptor statistik teori maklumat untuk membandingkan teori OD dan MT. Mencipta peta kekhususan untuk mendedahkan identiti metabolit utama. Analisis ini diperluaskan kepada populasi asli N. nasi dan spesies tembakau yang berkait rapat untuk menganalisis dengan lebih lanjut kovarians antara isyarat hormon tumbuhan dan induksi OD.
Untuk mendapatkan peta keseluruhan tentang keplastikan dan struktur metabolit daun tembakau herbivor, kami menggunakan aliran kerja analisis dan pengiraan yang dibangunkan sebelum ini untuk mengumpul dan mendekonvolusikan spektrum MS/MS bebas data resolusi tinggi daripada ekstrak tumbuhan (9) secara komprehensif. Kaedah yang tidak dibezakan ini (dipanggil MS/MS) boleh membina spektrum sebatian yang tidak berlebihan, yang kemudiannya boleh digunakan untuk semua analisis peringkat sebatian yang diterangkan di sini. Metabolit tumbuhan yang didekonvolusikan ini terdiri daripada pelbagai jenis, yang terdiri daripada ratusan hingga ribuan metabolit (kira-kira 500-1000-s/MS/MS di sini). Di sini, kami mempertimbangkan keplastikan metabolik dalam rangka kerja teori maklumat, dan mengukur kepelbagaian dan profesionalisme metabolit berdasarkan entropi Shannon bagi taburan frekuensi metabolik. Menggunakan formula yang dilaksanakan sebelum ini (8), kami mengira satu set penunjuk yang boleh digunakan untuk mengukur kepelbagaian metabolit (penunjuk Hj), pengkhususan profil metabolik (penunjuk δj) dan kekhususan metabolik bagi satu metabolit (penunjuk Si). Di samping itu, kami menggunakan Indeks Keplastikan Jarak Relatif (RDPI) untuk mengukur kebolehinduksian metabolit herbivor (Rajah 1A) (30). Dalam rangka kerja statistik ini, kami menganggap spektrum MS/MS sebagai unit maklumat asas, dan memproses kelimpahan relatif MS/MS ke dalam peta taburan frekuensi, dan kemudian menggunakan entropi Shannon untuk menganggarkan kepelbagaian metabolit daripadanya. Pengkhususan metabolit diukur dengan kekhususan purata spektrum MS/MS tunggal. Oleh itu, peningkatan kelimpahan beberapa kelas MS/MS selepas induksi herbivor diubah menjadi kebolehinduksian spektrum, RDPI dan pengkhususan, iaitu peningkatan indeks δj, kerana metabolit yang lebih khusus dihasilkan dan indeks Si yang tinggi dihasilkan. Penurunan indeks kepelbagaian Hj mencerminkan bahawa sama ada bilangan MS/MS yang dihasilkan berkurangan, atau taburan frekuensi profil berubah dalam arah yang kurang seragam, sambil mengurangkan ketidakpastian keseluruhannya. Melalui pengiraan indeks Si, adalah mungkin untuk mengetengahkan MS/MS yang diinduksi oleh herbivor tertentu, sebaliknya, MS/MS yang tidak bertindak balas terhadap induksi, yang merupakan penunjuk utama untuk membezakan ramalan MT dan OD.
(A) Deskriptor statistik yang digunakan untuk kebolehinduksian data MS/MS herbivor (H1 hingga Hx) (RDPI), kepelbagaian (indeks Hj), pengkhususan (indeks δj) dan kekhususan metabolit (indeks Si). Peningkatan dalam tahap pengkhususan (δj) menunjukkan bahawa, secara purata, lebih banyak metabolit spesifik herbivor akan dihasilkan, manakala penurunan dalam kepelbagaian (Hj) menunjukkan penurunan dalam penghasilan metabolit atau taburan metabolit yang tidak sekata dalam peta taburan. Nilai Si menilai sama ada metabolit adalah khusus untuk keadaan tertentu (di sini, herbivor) atau sebaliknya dikekalkan pada tahap yang sama. (B) Gambarajah konseptual ramalan teori pertahanan menggunakan paksi teori maklumat. Teori OD meramalkan bahawa serangan herbivor akan meningkatkan metabolit pertahanan, sekali gus meningkatkan δj. Pada masa yang sama, Hj berkurangan kerana profil disusun semula ke arah ketidakpastian maklumat metabolik yang berkurangan. Teori MT meramalkan bahawa serangan herbivor akan menyebabkan perubahan bukan arah dalam metabolit, sekali gus meningkatkan Hj sebagai penunjuk peningkatan ketidakpastian maklumat metabolik dan menyebabkan taburan rawak Si. Kami juga mencadangkan model campuran, MT terbaik, di mana beberapa metabolit dengan nilai pertahanan yang lebih tinggi akan meningkat secara ketara (nilai Si tinggi), manakala yang lain menunjukkan tindak balas rawak (nilai Si lebih rendah).
Menggunakan deskriptor teori maklumat, kami mentafsir teori OD untuk meramalkan bahawa perubahan metabolit khas yang disebabkan oleh herbivor dalam keadaan konstitutif yang tidak teraruh akan membawa kepada (i) peningkatan dalam kekhususan metabolik (indeks Si) yang memacu kekhususan metabolik (indeks δj). Peningkatan) kumpulan metabolit khas tertentu dengan nilai pertahanan yang lebih tinggi, dan (ii) penurunan kepelbagaian metabolit (indeks Hj) disebabkan oleh perubahan taburan frekuensi metabolik kepada taburan badan leptin yang lebih banyak. Pada tahap metabolit tunggal, taburan Si yang teratur dijangkakan, di mana metabolit akan meningkatkan nilai Si mengikut nilai pertahanannya (Rajah 1B). Selaras dengan ini, kami menerangkan teori MT untuk meramalkan bahawa pengujaan akan membawa kepada (i) perubahan tak berarah dalam metabolit yang mengakibatkan penurunan dalam indeks δj, dan (ii) peningkatan dalam indeks Hj disebabkan oleh peningkatan ketidakpastian metabolik. Atau kerawakan, yang boleh diukur oleh entropi Shannon dalam bentuk kepelbagaian umum. Bagi komposisi metabolik, teori MT akan meramalkan taburan rawak Si. Dengan mengambil kira bahawa metabolit tertentu berada di bawah keadaan tertentu dan keadaan lain tidak berada di bawah keadaan tertentu, dan nilai pertahanannya bergantung pada persekitaran, kami juga mencadangkan model pertahanan campuran, di mana δj dan Hj diagihkan dalam dua arah di sepanjang Si. Peningkatan dalam semua arah, hanya kumpulan metabolit tertentu yang mempunyai nilai pertahanan yang lebih tinggi akan meningkatkan Si secara khusus, manakala yang lain akan mempunyai taburan rawak (Rajah 1B).
Untuk menguji ramalan teori pertahanan yang ditakrifkan semula pada paksi deskriptor teori maklumat, kami telah membangkitkan larva herbivor pakar (Ms) atau generalis (Sl) pada daun Nepenthes pallens (Rajah 2A). Menggunakan analisis MS/MS, kami memperoleh 599 spektrum MS/MS yang tidak berlebihan (fail data S1) daripada ekstrak metanol tisu daun yang dikumpulkan selepas ulat makan. Menggunakan indeks RDPI, Hj, dan δj untuk menggambarkan konfigurasi semula kandungan maklumat dalam fail konfigurasi MS/MS mendedahkan corak yang menarik (Rajah 2B). Trend keseluruhannya ialah, seperti yang diterangkan oleh deskriptor maklumat, apabila ulat terus makan daun, tahap semua penyusunan semula metabolik meningkat dari semasa ke semasa: 72 jam selepas herbivor makan, RDPI meningkat dengan ketara. Berbanding dengan kawalan yang tidak rosak, Hj berkurangan dengan ketara, yang disebabkan oleh peningkatan tahap pengkhususan profil metabolik, yang diukur oleh indeks δj. Trend yang ketara ini selaras dengan ramalan teori OD, tetapi tidak konsisten dengan ramalan utama teori MT, yang percaya bahawa perubahan rawak (bukan arah) dalam tahap metabolit digunakan sebagai penyamaran pertahanan (Rajah 1B). Walaupun kandungan elisitor rembesan oral (OS) dan tingkah laku pemakanan kedua-dua herbivor ini berbeza, pemakanan langsung mereka menghasilkan perubahan yang serupa dalam arah Hj dan δj semasa tempoh penuaian 24 jam dan 72 jam. Satu-satunya perbezaan berlaku pada 72 jam RDPI. Berbanding dengan yang disebabkan oleh pemakanan Ms, metabolisme keseluruhan yang disebabkan oleh pemakanan Sl adalah lebih tinggi.
(A) Reka bentuk eksperimen: herbivor babi biasa (S1) atau pakar (Ms) diberi makan daun periuk kera yang dinyahgaramkan, manakala untuk herbivori simulasi, OS Ms (W + OSM) digunakan untuk mengendalikan tusukan luka kedudukan daun piawai. Larva S1 (W + OSSl) atau air (W + W). Kawalan (C) ialah daun yang tidak rosak. (B) Kebolehinduksian (RDPI berbanding carta kawalan), kepelbagaian (indeks Hj) dan indeks pengkhususan (indeks δj) yang dikira untuk peta metabolit khas (599 MS/MS; fail data S1). Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara antara pemberian makanan herbivor langsung dan kumpulan kawalan (ujian-t Pelajar dengan ujian-t berpasangan, *P<0.05 dan ***P<0.001). ns, tidak penting. (C) Indeks resolusi masa spektrum metabolit utama (kotak biru, asid amino, asid organik dan gula; fail data S2) dan spektrum metabolit khas (kotak merah 443 MS/MS; fail data S1) selepas rawatan herbivori simulasi. Jalur warna merujuk kepada selang keyakinan 95%. Asterisk menunjukkan perbezaan ketara antara rawatan dan kawalan [analisis varians kuadratik (ANOVA), diikuti oleh perbezaan ketara Tukey (HSD) untuk perbandingan berganda post hoc, *P<0.05, **P<0.01 Dan *** P <0.001]. (D) Pengkhususan plot serakan dan profil metabolit khas (sampel berulang dengan rawatan berbeza).
Untuk meneroka sama ada pembentukan semula yang disebabkan oleh herbivor pada peringkat metabolit tercermin dalam perubahan dalam tahap metabolit individu, kami mula-mula menumpukan pada metabolit yang dikaji sebelum ini dalam daun Nepenthes pallens dengan rintangan herbivor yang terbukti. Amida fenolik ialah konjugat hidroksisinamida-poliamina yang terkumpul semasa proses herbivor serangga dan diketahui mengurangkan prestasi serangga (32). Kami mencari prekursor MS/MS yang sepadan dan memplot lengkung kinetik kumulatifnya (Rajah S1). Tidak menghairankan, derivatif fenol yang tidak terlibat secara langsung dalam pertahanan terhadap herbivor, seperti asid klorogenik (CGA) dan rutin, dikurangkan regulasinya selepas herbivor. Sebaliknya, herbivor boleh menjadikan fenol amida sangat kuat. Pemberian makanan berterusan kedua-dua herbivor menghasilkan spektrum pengujaan fenolamida yang hampir sama, dan corak ini amat jelas untuk sintesis fenolamida de novo. Fenomena yang sama akan diperhatikan apabila meneroka laluan 17-hidroksigeranyl nonanediol diterpena glikosida (17-HGL-DTG), yang menghasilkan sebilangan besar diterpena asiklik dengan fungsi anti-herbivor yang berkesan (33), yang mana Ms Feeding dengan Sl mencetuskan profil ekspresi yang serupa (Rajah S1)).
Kelemahan yang mungkin berlaku dalam eksperimen pemakanan herbivor secara langsung adalah perbezaan dalam kadar penggunaan daun dan masa pemakanan herbivor, yang menjadikannya sukar untuk menghapuskan kesan khusus herbivor yang disebabkan oleh luka dan herbivor. Untuk menyelesaikan dengan lebih baik kekhususan spesies herbivor bagi tindak balas metabolik daun yang diinduksi, kami mensimulasikan pemakanan larva Ms dan Sl dengan segera menggunakan OS yang baru dikumpulkan (OSM dan OSS1) pada tusukan standard W bagi kedudukan daun yang konsisten. Prosedur ini dipanggil rawatan W + OS, dan ia menyeragamkan induksi dengan tepat menetapkan masa permulaan tindak balas yang ditimbulkan oleh herbivor tanpa menyebabkan kesan mengelirukan perbezaan dalam kadar atau kuantiti kehilangan tisu (Rajah 2A) (34). Menggunakan saluran analisis dan pengiraan MS/MS, kami memperoleh 443 spektrum MS/MS (fail data S1), yang bertindih dengan spektrum yang dipasang sebelum ini daripada eksperimen pemakanan langsung. Analisis teori maklumat set data MS/MS ini menunjukkan bahawa pengaturcaraan semula metabolit khusus daun dengan mensimulasikan herbivor menunjukkan dorongan khusus OS (Rajah 2C). Khususnya, berbanding dengan rawatan OSS1, OSM menyebabkan peningkatan pengkhususan metabolit pada 4 jam. Perlu diingatkan bahawa berbanding dengan set data eksperimen pemakanan herbivor langsung, kinetik metabolik yang divisualisasikan dalam ruang dua dimensi menggunakan Hj dan δj sebagai koordinat dan arah pengkhususan metabolit sebagai tindak balas kepada rawatan herbivor simulasi dari semasa ke semasa Peningkatan konsisten (Rajah 2D). Pada masa yang sama, kami mengukur kandungan asid amino, asid organik dan gula (fail data S2) untuk menyiasat sama ada peningkatan sasaran dalam kepakaran metabolit ini adalah disebabkan oleh konfigurasi semula metabolisme karbon pusat sebagai tindak balas kepada herbivor simulasi (Rajah S2). Untuk menjelaskan corak ini dengan lebih baik, kami memantau selanjutnya kinetik pengumpulan metabolik laluan fenolamida dan 17-HGL-DTG yang telah dibincangkan sebelum ini. Induksi herbivor khusus OS diubah menjadi corak penyusunan semula pembezaan dalam metabolisme fenolamida (Rajah S3). Amida fenolik yang mengandungi bahagian kumarin dan kafein secara pilihannya diinduksi oleh OSS1, manakala OSM mencetuskan induksi khusus konjugat ferulil. Bagi laluan 17-HGL-DTG, induksi OS pembezaan oleh produk malonisasi dan dimalonilasi hiliran dikesan (Rajah S3).
Seterusnya, kami mengkaji keplastikan transkriptom yang disebabkan oleh OS menggunakan set data mikroarray kursus masa, yang mensimulasikan penggunaan OSM untuk merawat daun tumbuhan roset dalam herbivor. Kinetik persampelan pada asasnya bertindih dengan kinetik yang digunakan dalam kajian metabolomik ini (35). Berbanding dengan konfigurasi semula metabolom di mana keplastikan metabolik meningkat terutamanya dari semasa ke semasa, kami memerhatikan pecahan transkripsi sementara dalam daun yang disebabkan oleh Ms, di mana kebolehinduksian transkriptom (RDPI) dan pengkhususan (δj) berada pada 1. Terdapat peningkatan ketara dalam jam, dan kepelbagaian (Hj) pada masa ini, ekspresi BMP1 berkurangan dengan ketara, diikuti dengan kelonggaran pengkhususan transkriptom (Rajah S4). Keluarga gen metabolik (seperti P450, glikosiltransferase, dan BAHD asiltransferase) mengambil bahagian dalam proses pemasangan metabolit khas daripada unit struktur yang berasal daripada metabolisme primer, mengikuti model pengkhususan tinggi awal yang dinyatakan di atas. Sebagai kajian kes, laluan fenilalanina dianalisis. Analisis tersebut mengesahkan bahawa gen teras dalam metabolisme fenolamida sangat teraruh OS dalam herbivor berbanding tumbuhan yang tidak tertarik, dan sejajar rapat dalam corak ekspresi mereka. Faktor transkripsi MYB8 dan gen struktur PAL1, PAL2, C4H dan 4CL di hulu laluan ini menunjukkan permulaan transkripsi awal. Asiltransferase yang memainkan peranan dalam pemasangan akhir fenolamida, seperti AT1, DH29, dan CV86, mempamerkan corak peningkatan regulasi yang berpanjangan (Rajah S4). Pemerhatian di atas menunjukkan bahawa permulaan awal pengkhususan transkriptom dan peningkatan pengkhususan metabolomik yang kemudian adalah mod gandingan, yang mungkin disebabkan oleh sistem pengawalseliaan segerak yang memulakan tindak balas pertahanan yang kuat.
Konfigurasi semula dalam isyarat hormon tumbuhan bertindak sebagai lapisan pengawalseliaan yang mengintegrasikan maklumat herbivor untuk memprogram semula fisiologi tumbuhan. Selepas simulasi herbivor, kami mengukur dinamik kumulatif kategori hormon tumbuhan utama dan memvisualisasikan ekspresi bersama temporal antara mereka [pekali korelasi Pearson (PCC)> 0.4] (Rajah 3A). Seperti yang dijangkakan, hormon tumbuhan yang berkaitan dengan biosintesis dikaitkan dalam rangkaian ekspresi bersama hormon tumbuhan. Di samping itu, kekhususan metabolik (indeks Si) dipetakan ke rangkaian ini untuk menonjolkan hormon tumbuhan yang disebabkan oleh rawatan yang berbeza. Dua bidang utama tindak balas khusus herbivor dilukis: satu berada dalam kelompok JA, di mana JA (bentuk aktif biologinya JA-Ile) dan derivatif JA lain menunjukkan skor Si tertinggi; yang satu lagi ialah etilena (ET). Giberelin hanya menunjukkan peningkatan sederhana dalam kekhususan herbivor, manakala hormon tumbuhan lain, seperti sitokinin, auksin dan asid absisik, mempunyai kekhususan induksi yang rendah untuk herbivor. Berbanding dengan penggunaan W + W sahaja, penguatan nilai puncak derivatif JA melalui aplikasi OS (W + OS) pada asasnya boleh diubah menjadi penunjuk khusus JA yang kuat. Tanpa diduga, OSM dan OSS1 dengan kandungan elisitor yang berbeza diketahui menyebabkan pengumpulan JA dan JA-Ile yang serupa. Berbeza dengan OSS1, OSM secara khusus dan kuat diinduksi oleh OSM, manakala OSS1 tidak menguatkan tindak balas luka basal (Rajah 3B).
(A) Analisis rangkaian ko-ekspresi berdasarkan pengiraan PCC bagi simulasi kinetik pengumpulan hormon tumbuhan yang disebabkan oleh herbivor. Nod mewakili hormon tumbuhan tunggal, dan saiz nod mewakili indeks Si khusus kepada hormon tumbuhan antara rawatan. (B) Pengumpulan JA, JA-Ile dan ET dalam daun yang disebabkan oleh rawatan berbeza yang ditunjukkan oleh warna berbeza: aprikot, W + OSM; biru, W + OSSl; hitam, W + W; kelabu, C (kawalan). Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara antara rawatan dan kawalan (ANOVA dua hala diikuti oleh perbandingan berganda post hoc Tukey HSD, *** P <0.001). Analisis teori maklumat (C)697 MS/MS (fail data S1) dalam biosintesis JA dan spektrum persepsi terjejas (irAOC dan irCOI1) dan (D)585 MS/MS (fail data S1) dalam ETR1 dengan isyarat ET terjejas. Dua rawatan herbivor simulasi mencetuskan garisan tumbuhan dan loji kawalan kenderaan kosong (EV). Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara antara rawatan W+OS dan kawalan tidak rosak (ANOVA dua hala diikuti oleh perbandingan berganda post hoc Tukey HSD, *P<0.05, **P<0.01 dan ***P<0.001). (E) Graf berselerak bagi penentangan berselerak terhadap pengkhususan. Warna mewakili strain yang diubah suai secara genetik yang berbeza; simbol mewakili kaedah rawatan yang berbeza: segi tiga, W + OSS1; segi empat tepat, W + OSM; bulatan C
Seterusnya, kami menggunakan strain Nepenthes yang dilemahkan (irCOI1 dan sETR1) yang diubah suai secara genetik dalam langkah-langkah utama biosintesis JA dan ET (irAOC dan irACO) dan persepsi (irCOI1 dan sETR1) untuk menganalisis metabolisme kedua-dua hormon tumbuhan ini pada herbivor. Sumbangan relatif pengaturcaraan semula. Selaras dengan eksperimen terdahulu, kami mengesahkan induksi herbivor-OS dalam tumbuhan pembawa kosong (EV) (Rajah 3, C hingga D) dan penurunan keseluruhan dalam indeks Hj yang disebabkan oleh OSM, manakala indeks δj meningkat. Tindak balas lebih ketara daripada tindak balas yang dicetuskan oleh OSS1. Graf dua baris menggunakan Hj dan δj sebagai koordinat menunjukkan penyahkawalseliaan khusus (Rajah 3E). Trend yang paling jelas ialah dalam strain yang kekurangan isyarat JA, kepelbagaian metabolit dan perubahan pengkhususan yang disebabkan oleh herbivor hampir dihapuskan sepenuhnya (Rajah 3C). Sebaliknya, persepsi ET senyap dalam tumbuhan sETR1, walaupun kesan keseluruhan terhadap perubahan dalam metabolisme herbivor jauh lebih rendah daripada isyarat JA, melemahkan perbezaan dalam indeks Hj dan δj antara pengujaan OSM dan OSS1 (Rajah 3D dan Rajah S5). . Ini menunjukkan bahawa sebagai tambahan kepada fungsi teras transduksi isyarat JA, transduksi isyarat ET juga berfungsi sebagai penalaan halus tindak balas metabolik spesifik spesies herbivor. Selaras dengan fungsi penalaan halus ini, tiada perubahan dalam kebolehinduksian metabolit keseluruhan dalam tumbuhan sETR1. Sebaliknya, berbanding dengan tumbuhan sETR1, tumbuhan irACO mendorong amplitud keseluruhan perubahan metabolik yang serupa yang disebabkan oleh herbivor, tetapi menunjukkan skor Hj dan δj yang berbeza dengan ketara antara cabaran OSM dan OSS1 (Rajah S5).
Untuk mengenal pasti metabolit khusus yang mempunyai sumbangan penting kepada tindak balas spesifik spesies herbivor dan memperhalusi penghasilannya melalui isyarat ET, kami menggunakan kaedah MS/MS struktur yang dibangunkan sebelum ini. Kaedah ini bergantung pada kaedah dwi-pengelompokan untuk membuat kesimpulan semula keluarga metabolik daripada serpihan MS/MS [produk titik ternormalisasi (NDP)] dan skor persamaan berdasarkan kehilangan neutral (NL). Set data MS/MS yang dibina melalui analisis garisan transgenik ET menghasilkan 585 MS/MS (fail data S1), yang diselesaikan dengan mengelompokkannya ke dalam tujuh modul MS/MS utama (M) (Rajah 4A). Sebahagian daripada modul ini padat dengan metabolit khas yang dicirikan sebelum ini: contohnya, M1, M2, M3, M4 dan M7 kaya dengan pelbagai derivatif fenol (M1), glikosida flavonoid (M2), gula asil (M3 Dan M4), dan 17-HGL-DTG (M7). Di samping itu, maklumat khusus metabolik (indeks Si) bagi satu metabolit dalam setiap modul dikira, dan taburan Sinya boleh dilihat secara intuitif. Pendek kata, spektrum MS/MS yang mempamerkan kekhususan herbivori dan genotip yang tinggi dicirikan oleh nilai Si yang tinggi, dan statistik kurtosis menunjukkan taburan bulu di sudut ekor kanan. Satu taburan koloid tanpa lemak dikesan dalam M1, di mana fenol amida menunjukkan pecahan Si tertinggi (Rajah 4B). 17-HGL-DTG herbivor yang boleh diaruh yang dinyatakan sebelum ini dalam M7 menunjukkan skor Si yang sederhana, menunjukkan tahap peraturan pembezaan yang sederhana antara kedua-dua jenis OS. Sebaliknya, kebanyakan metabolit khusus yang dihasilkan secara konstitutif, seperti rutin, CGA, dan gula asil, adalah antara skor Si terendah. Untuk meneroka kerumitan struktur dan taburan Si antara metabolit khas dengan lebih baik, rangkaian molekul telah dibina untuk setiap modul (Rajah 4B). Satu ramalan penting teori OD (diringkaskan dalam Rajah 1B) ialah penyusunan semula metabolit khas selepas herbivori sepatutnya membawa kepada perubahan sehala dalam metabolit dengan nilai pertahanan yang tinggi, terutamanya dengan meningkatkan kekhususannya (berbanding dengan taburan rawak) Mod) Metabolit pertahanan yang diramalkan oleh teori MT. Kebanyakan derivatif fenol yang terkumpul dalam M1 berkaitan secara fungsional dengan penurunan prestasi serangga (32). Apabila membandingkan nilai Si dalam metabolit M1 antara daun teraruh dan daun konstituen tumbuhan kawalan EV pada 24 jam, kami mendapati bahawa kekhususan metabolik banyak metabolit selepas serangga herbivori mempunyai trend peningkatan yang ketara (Rajah 4C). Peningkatan khusus dalam nilai Si dikesan hanya dalam fenolamida pertahanan, tetapi tiada peningkatan dalam nilai Si dikesan dalam fenol lain dan metabolit yang tidak diketahui yang wujud bersama dalam modul ini. Ini adalah model khusus, yang berkaitan dengan teori OD. Ramalan utama perubahan metabolik yang disebabkan oleh herbivor adalah konsisten. Untuk menguji sama ada keistimewaan spektrum fenolamida ini diinduksi oleh ET khusus OS, kami memplotkan indeks metabolit Si dan menyebabkan nilai ekspresi pembezaan antara OSM dan OSS1 dalam genotip EV dan sETR1 (Rajah 4D). Dalam sETR1, perbezaan yang diinduksi oleh fenamida antara OSM dan OSS1 telah berkurangan dengan ketara. Kaedah dwi-pengelompokan juga digunakan pada data MS/MS yang dikumpulkan dalam strain dengan JA yang tidak mencukupi untuk membuat kesimpulan modul MS/MS utama yang berkaitan dengan pengkhususan metabolik yang dikawal selia oleh JA (Rajah S6).
(A) Keputusan pengelompokan 585 MS/MS berdasarkan serpihan kongsi (persamaan NDP) dan kehilangan neutral kongsi (persamaan NL) menghasilkan modul (M) yang konsisten dengan keluarga sebatian yang diketahui, atau oleh komposisi Metabolit yang tidak diketahui atau dimetabolismekan dengan buruk. Di sebelah setiap modul, taburan spesifik metabolit (MS/MS) (Si) ditunjukkan. (B) Rangkaian molekul modular: Nod mewakili MS/MS dan tepi, skor MS/MS NDP (merah) dan NL (biru) (potongan, > 0.6). Indeks kekhususan metabolit yang digredkan (Si) diwarnakan berdasarkan modul (kiri) dan dipetakan kepada rangkaian molekul (kanan). (C) Modul M1 tumbuhan EV dalam keadaan konstitutif (kawalan) dan teraruh (herbivor simulasi) pada 24 jam: gambarajah rangkaian molekul (nilai Si ialah saiz nod, fenolamida pertahanan diserlahkan dengan warna biru). (D) Gambarajah rangkaian molekul M1 bagi garis spektrum sETR1 dengan persepsi EV dan ET yang terjejas: sebatian fenolik yang diwakili oleh nod bulatan hijau, dan perbezaan ketara (nilai P) antara rawatan W + OSM dan W + OSS1 sebagai saiz Nod. CP, N-kafeoil-tirosin; CS, N-kafeoil-spermidin; FP, asid N-ferulik ester-asid urik; FS, N-ferulil-spermidin; CoP, N', N “-Coumarolil-tirosin; DCS, N', N”-dicaffeoil-spermidin; CFS, N', N”-kafeoil, feruloil-spermidin; Lycium barbarum dalam wolfberry Son; Nick. O-AS, gula O-asil.
Kami melanjutkan lagi analisis daripada genotip Nepenthes tunggal yang dilemahkan kepada populasi semula jadi, di mana perubahan intraspesifik yang kuat dalam tahap JA herbivor dan tahap metabolit tertentu telah diterangkan sebelum ini dalam populasi semula jadi (26). Gunakan set data ini untuk merangkumi 43 plasma nutfah. Plasma nutfah ini terdiri daripada 123 spesies tumbuhan daripada N. pallens. Tumbuhan ini diambil daripada biji benih yang dikumpulkan di habitat asli yang berbeza di Utah, Nevada, Arizona, dan California (Rajah S7), kami mengira kepelbagaian metabolit (di sini dipanggil tahap populasi) (kepelbagaian β) dan pengkhususan yang disebabkan oleh OSM. Selaras dengan kajian terdahulu, kami memerhatikan pelbagai perubahan metabolik di sepanjang paksi Hj dan δj, menunjukkan bahawa plasma nutfah mempunyai perbezaan yang ketara dalam keplastikan tindak balas metaboliknya terhadap herbivor (Rajah S7). Organisasi ini mengingatkan pemerhatian terdahulu tentang julat dinamik perubahan JA yang disebabkan oleh herbivor, dan telah mengekalkan nilai yang sangat tinggi dalam populasi tunggal (26, 36). Dengan menggunakan JA dan JA-Ile untuk menguji korelasi tahap keseluruhan antara Hj dan δj, kami mendapati terdapat korelasi positif yang signifikan antara JA dan indeks kepelbagaian dan pengkhususan metabolit β (Rajah S7). Ini menunjukkan bahawa heterogeniti yang disebabkan oleh herbivor dalam induksi JA yang dikesan pada tahap populasi mungkin disebabkan oleh polimorfisme metabolik utama yang disebabkan oleh pemilihan daripada herbivor serangga.
Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa jenis tembakau sangat berbeza dari segi jenis dan pergantungan relatif terhadap pertahanan metabolik yang diinduksi dan konstitutif. Adalah dipercayai bahawa perubahan dalam transduksi isyarat anti-herbivor dan keupayaan pertahanan dikawal oleh tekanan populasi serangga, kitaran hayat tumbuhan, dan kos pengeluaran pertahanan dalam niche tempat spesies tertentu tumbuh. Kami mengkaji konsistensi pembentukan semula metabolit daun yang diinduksi oleh herbivor daripada enam spesies Nicotiana yang berasal dari Amerika Utara dan Amerika Selatan. Spesies ini berkait rapat dengan Nepenthes Amerika Utara, iaitu Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. rumput yang dilemahkan, Nicotiana tabacum, tembakau linear, tembakau (Nicotiana spegazzinii) dan tembakau daun tembakau (Nicotiana obtusifolia) (Rajah 5A) (37). Enam daripada spesies ini, termasuk spesies N. yang dicirikan dengan baik, adalah tumbuhan tahunan daripada clade petunia, dan obtusifolia N. adalah tumbuhan saka daripada clade saudara Trigonophyllae (38). Seterusnya, induksi W + W, W + OSM dan W + OSS1 telah dilakukan ke atas tujuh spesies ini untuk mengkaji penyusunan semula metabolik peringkat spesies bagi pemakanan serangga.
(A) Pokok filogenetik bootstrap berdasarkan kemungkinan maksimum [untuk sintesis glutamin nuklear (38)] dan taburan geografi tujuh spesies Nicotiana yang berkait rapat (warna berbeza) (37). (B) Plot serakan kepelbagaian khusus untuk profil metabolik tujuh spesies Nicotiana (939 MS/MS; fail data S1). Pada peringkat spesies, kepelbagaian metabolit berkorelasi negatif dengan tahap pengkhususan. Analisis korelasi peringkat spesies antara kepelbagaian metabolik dan pengkhususan dan pengumpulan JA ditunjukkan dalam Rajah 2. S9. Warna, jenis berbeza; segi tiga, W + OSS1; segi empat tepat, W + OSM; (C) Dinamik Nicotiana JA dan JA-Ile disusun mengikut amplitud pengujaan OS (ANOVA dua hala dan perbandingan pasca-berganda Tukey HSD, * P <0.05, ** P <0.01 dan * ** Untuk perbandingan W + OS dan W + W, P <0.001). Plot kotak (D) kepelbagaian dan (E) pengkhususan setiap spesies selepas mensimulasikan herbivor dan metil JA (MeJA). Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara antara W + OS dan W + W atau lanolin campur W (Lan + W) atau Lan campur MeJA (Lan + MeJa) dan kawalan Lan (analisis varians dua hala, diikuti dengan perbandingan berganda post hoc HSD Tukey, *P<0.05, **P<0.01 dan ***P<0.001).
Dengan menggunakan kaedah kelompok dua, kami mengenal pasti 9 modul 939 MS/MS (fail data S1). Komposisi MS/MS yang dikonfigurasikan semula oleh rawatan yang berbeza sangat berbeza antara modul yang berbeza antara spesies (Rajah S8). Visualisasikan Hj (dirujuk di sini sebagai kepelbagaian-γ peringkat spesies) dan δj mendedahkan bahawa spesies yang berbeza mengagregatkan diri ke dalam kumpulan yang sangat berbeza dalam ruang metabolik, di mana pembahagian peringkat spesies biasanya lebih ketara daripada pengujaan. Kecuali N. linear dan N. obliquus, mereka mempamerkan julat dinamik kesan induksi yang luas (Rajah 5B). Sebaliknya, spesies seperti N. purpurea dan N. obtusifolia mempunyai tindak balas metabolik yang kurang jelas terhadap rawatan, tetapi metabolitnya lebih pelbagai. Taburan spesifik spesies bagi tindak balas metabolik yang diinduksi menghasilkan korelasi negatif yang ketara antara pengkhususan dan kepelbagaian gama (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). Perubahan tahap JA yang disebabkan oleh OS berkorelasi positif dengan pengkhususan metabolit, dan berkorelasi negatif dengan kepelbagaian gama metabolik yang dipamerkan oleh setiap spesies (Rajah 5B dan Rajah S9). Perlu diingatkan bahawa spesies yang secara lazimnya dirujuk sebagai spesies "respons isyarat" dalam Rajah 5C, seperti Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute, dan Nepenthes dilemahkan, menyebabkan tanda-tanda yang ketara pada 30 minit. Wabak JA dan JA-Ile khusus OS baru-baru ini, manakala bakteria lain yang dipanggil "tidak responsif isyarat", seperti Nepenthes mills, Nepenthes powdery dan N. obtusifolia hanya menunjukkan induksi JA-Ile Edge tanpa sebarang kekhususan OS (Rajah 5C). Pada tahap metabolik, seperti yang dinyatakan di atas, untuk Nepenthes yang dilemahkan, bahan responsif isyarat menunjukkan kekhususan OS dan meningkatkan δj dengan ketara, sambil mengurangkan Hj. Kesan priming khusus OS ini tidak dikesan dalam spesies yang dikelaskan sebagai spesies bukan reaktif isyarat (Rajah 5, D dan E). Metabolit khusus OS dikongsi lebih kerap antara spesies yang responsif isyarat, dan kluster isyarat ini berkelompok dengan spesies dengan tindak balas isyarat yang lebih lemah, manakala spesies dengan tindak balas isyarat yang lebih lemah menunjukkan kurang saling bergantung (Rajah S8). Keputusan ini menunjukkan bahawa induksi JA khusus OS dan konfigurasi semula khusus OS bagi metabolit hiliran digandingkan pada peringkat spesies.
Seterusnya, kami menggunakan pes lanolin yang mengandungi metil JA (MeJA) untuk merawat tumbuhan bagi menyiasat sama ada mod gandingan ini dihadkan oleh ketersediaan JA yang digunakan oleh JA eksogen, yang akan berada dalam sitoplasma tumbuhan. Penyahpenyesterifikasian pantas adalah JA. Kami mendapati trend yang sama bagi perubahan beransur-ansur daripada spesies yang responsif isyarat kepada spesies yang tidak responsif isyarat yang disebabkan oleh bekalan JA yang berterusan (Rajah 5, D dan E). Pendek kata, rawatan MeJA telah memprogram semula metabolit nematod linear, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, dan N. mikimotoi dengan kuat, mengakibatkan peningkatan ketara dalam δj dan penurunan dalam Hj. N. purpurea hanya menunjukkan peningkatan dalam δj, tetapi tidak dalam Hj. N. obtusifolia, yang sebelum ini telah ditunjukkan untuk mengumpul tahap JA yang sangat rendah, juga bertindak balas dengan buruk terhadap rawatan MeJA dari segi konfigurasi semula metabolit. Keputusan ini menunjukkan bahawa penghasilan JA atau transduksi isyarat dihadkan secara fisiologi dalam spesies yang tidak responsif isyarat. Untuk menguji hipotesis ini, kami mengkaji empat spesies (N. pallens, N. mills, N. pink dan N. microphylla) yang diinduksi oleh W + W, W + OSM dan W + OSS1 Transkriptom (39). Selaras dengan corak pembentukan semula metabolit, spesies tersebut terpisah dengan baik dalam ruang transkriptom, antaranya N. yang dilemahkan menunjukkan RDPI yang diinduksi OS tertinggi, manakala N. gracilis mempunyai yang terendah (Rajah 6A). Walau bagaimanapun, didapati bahawa kepelbagaian transkriptom yang diinduksi oleh N. oblonga adalah yang terendah antara empat spesies, bertentangan dengan kepelbagaian metabonomi tertinggi N. oblonga yang ditunjukkan sebelum ini dalam tujuh spesies. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa satu set gen yang berkaitan dengan isyarat pertahanan awal, termasuk isyarat JA, menjelaskan kekhususan tindak balas pertahanan awal yang diinduksi oleh elisitor berkaitan herbivor dalam spesies Nicotiana (39). Membandingkan laluan isyarat JA antara empat spesies ini mendedahkan corak yang menarik (Rajah 6B). Kebanyakan gen dalam laluan ini, seperti AOC, OPR3, ACX dan COI1, menunjukkan tahap induksi yang agak tinggi dalam empat spesies ini. Walau bagaimanapun, gen utama, JAR4, menukarkan JA kepada bentuk transkrip terkumpul JA-Ile yang aktif secara biologi, dan tahap transkripsinya adalah sangat rendah, terutamanya dalam N. mills, Nepenthes pieris dan N. microphylla. Di samping itu, hanya transkrip gen lain AOS yang tidak dikesan dalam N. bifidum. Perubahan dalam ekspresi gen ini mungkin bertanggungjawab untuk fenotip ekstrem yang disebabkan oleh penghasilan JA yang rendah dalam spesies anergik isyarat dan induksi N. gracilis.
(A) Analisis teori maklumat bagi pengaturcaraan semula tindak balas transkripsi awal bagi empat spesies tembakau yang berkait rapat yang disampel 30 minit selepas induksi herbivori. RDPI dikira dengan membandingkan daun yang diinduksi oleh OS herbivor dengan kawalan luka. Warna menunjukkan spesies yang berbeza, dan simbol menunjukkan kaedah rawatan yang berbeza. (B) Analisis ekspresi gen dalam laluan isyarat JA antara empat spesies. Laluan JA yang dipermudahkan ditunjukkan di sebelah plot kotak. Warna yang berbeza menunjukkan kaedah pemprosesan yang berbeza. Asterisk menunjukkan bahawa terdapat perbezaan yang ketara antara rawatan W + OS dan kawalan W + W (untuk ujian-t Pelajar untuk perbezaan berpasangan, *P<0.05, **P<0.01 dan ***P<0.001). OPDA, asid 12-oksofitodienoik; OPC-8: asid 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenyl)-siklopentana-1-oktanoik.
Dalam bahagian terakhir, kami mengkaji bagaimana pembentukan semula metabolit spesies tumbuhan yang berbeza mengikut spesies serangga boleh tahan terhadap herbivor. Kajian terdahulu menekankan genus Nicotiana. Rintangan mereka terhadap Ms dan larva sangat berbeza (40). Di sini, kami mengkaji hubungan antara model ini dan keplastikan metabolik mereka. Menggunakan empat spesies tembakau di atas, dan menguji korelasi antara kepelbagaian dan pengkhususan metabolit yang disebabkan oleh herbivor dan rintangan tumbuhan terhadap Ms dan Sl, kami mendapati rintangan, kepelbagaian dan pengkhususan terhadap Sl All generalis berkorelasi positif, manakala korelasi antara rintangan terhadap wanita pakar dan pengkhususan adalah lemah, dan korelasi dengan kepelbagaian tidak signifikan (Rajah S10). Berkenaan dengan rintangan S1, kedua-dua N. chinensis dan N. gracilis yang dilemahkan, yang sebelum ini ditunjukkan menunjukkan tahap transduksi isyarat JA dan keplastikan metabolit, mempunyai tindak balas yang sangat berbeza terhadap induksi herbivor, dan mereka juga menunjukkan rintangan tinggi yang serupa. Jantina.
Dalam tempoh enam puluh tahun yang lalu, teori pertahanan tumbuhan telah menyediakan kerangka teori, yang berdasarkannya para penyelidik telah meramalkan sejumlah besar evolusi dan fungsi metabolit khusus tumbuhan. Kebanyakan teori ini tidak mengikuti prosedur biasa inferens yang kuat (41). Mereka mencadangkan ramalan utama (3) pada tahap analisis yang sama. Apabila pengujian ramalan utama membolehkan teori tertentu dianalisis, ini akan menjadikan bidang ini bergerak ke hadapan. Disokong, tetapi menolak yang lain (42). Sebaliknya, teori baharu membuat ramalan pada tahap analisis yang berbeza dan menambah lapisan pertimbangan deskriptif baharu (42). Walau bagaimanapun, dua teori yang dicadangkan pada tahap fungsian, MT dan OD, boleh dijelaskan dengan mudah sebagai ramalan penting tentang perubahan metabolik khusus yang disebabkan oleh herbivor: Teori OD percaya bahawa perubahan dalam "ruang" metabolik khusus adalah sangat berarah. Teori MT percaya bahawa perubahan ini akan tidak berarah dan terletak secara rawak dalam ruang metabolik, dan cenderung mempunyai metabolit nilai pertahanan yang tinggi. Pemeriksaan ramalan OD dan MT sebelum ini telah diuji menggunakan set sebatian "pertahanan" a priori yang sempit. Ujian berpusatkan metabolit ini menghalang keupayaan untuk menganalisis tahap dan trajektori konfigurasi semula metabolit semasa herbivori, dan tidak membenarkan ujian dalam rangka kerja statistik yang konsisten memerlukan ramalan utama yang boleh dianggap secara keseluruhan Mengukur perubahan dalam metabolit tumbuhan. Di sini, kami menggunakan teknologi inovatif dalam metabolomik berdasarkan MS pengiraan dan menjalankan analisis MS dekonvolusi dalam mata wang umum deskriptor teori maklumat untuk menguji perbezaan antara kedua-duanya yang dicadangkan pada peringkat metabolomik global. Ramalan utama teori ini. Teori maklumat telah digunakan dalam pelbagai bidang, terutamanya dalam konteks biodiversiti dan penyelidikan aliran nutrien (43). Walau bagaimanapun, setahu kami, ini adalah aplikasi pertama yang digunakan untuk menggambarkan ruang maklumat metabolik tumbuhan dan menyelesaikan masalah ekologi yang berkaitan dengan perubahan metabolik sementara sebagai tindak balas kepada isyarat persekitaran. Khususnya, keupayaan kaedah ini terletak pada keupayaannya untuk membandingkan corak dalam dan antara spesies tumbuhan untuk mengkaji bagaimana herbivor telah berevolusi daripada spesies yang berbeza kepada corak makroevolusi antara spesies pada tahap evolusi yang berbeza. Metabolisme.
Analisis komponen utama (PCA) menukar set data multivariat kepada ruang pengurangan dimensi supaya trend utama data dapat dijelaskan, jadi ia biasanya digunakan sebagai teknik penerokaan untuk menghuraikan set data, seperti metabolit dekonvolusi. Walau bagaimanapun, pengurangan dimensi akan kehilangan sebahagian daripada kandungan maklumat dalam set data, dan PCA tidak dapat memberikan maklumat kuantitatif tentang ciri-ciri yang sangat relevan dengan teori ekologi, seperti: bagaimana herbivor mengkonfigurasi semula kepelbagaian dalam bidang khusus (contohnya, kekayaan, taburan) dan kelimpahan) metabolit? Metabolit yang manakah merupakan peramal keadaan teraruh herbivor tertentu? Dari perspektif kekhususan, kepelbagaian dan kebolehinduksian, kandungan maklumat profil metabolit khusus daun diuraikan, dan didapati bahawa pemakanan herbivor boleh mengaktifkan metabolisme tertentu. Tanpa diduga, kami mendapati bahawa, seperti yang diterangkan dalam penunjuk teori maklumat yang dilaksanakan, situasi metabolik yang terhasil mempunyai pertindihan yang besar selepas serangan dua herbivor (generalis makan malam Sl) dan pakar Solanaceae Ms. Walaupun tingkah laku dan kepekatan pemakanan mereka berbeza dengan ketara. Pemula konjugat asid lemak-asid amino (FAC) dalam OS (31). Dengan menggunakan OS herbivor untuk merawat luka tusukan piawai, rawatan herbivor simulasi juga menunjukkan trend yang serupa. Prosedur piawai ini untuk mensimulasikan tindak balas tumbuhan terhadap serangan herbivor menghapuskan faktor pengganggu yang disebabkan oleh perubahan dalam tingkah laku makan herbivor, yang membawa kepada pelbagai tahap kerosakan pada masa yang berbeza (34). FAC, yang diketahui sebagai punca utama OSM, mengurangkan JAS dan tindak balas hormon tumbuhan lain dalam OSS1, manakala OSS1 berkurangan beratus-ratus kali ganda (31). Walau bagaimanapun, OSS1 menyebabkan tahap pengumpulan JA yang serupa berbanding OSM. Sebelum ini telah ditunjukkan bahawa tindak balas JA dalam Nepenthes yang dilemahkan sangat sensitif terhadap OSM, di mana FAC boleh mengekalkan aktivitinya walaupun dicairkan 1:1000 dengan air (44). Oleh itu, berbanding dengan OSM, walaupun FAC dalam OSS1 sangat rendah, ia mencukupi untuk mendorong wabak JA yang mencukupi. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa protein seperti porin (45) dan oligosakarida (46) boleh digunakan sebagai petunjuk molekul untuk mencetuskan tindak balas pertahanan tumbuhan dalam OSS1. Walau bagaimanapun, masih belum jelas sama ada elisitor dalam OSS1 ini bertanggungjawab untuk pengumpulan JA yang diperhatikan dalam kajian semasa.
Walaupun terdapat beberapa kajian yang menggambarkan perbezaan cap jari metabolik yang disebabkan oleh penggunaan herbivor yang berbeza atau JA atau SA eksogen (asid salisilik) (47), tiada siapa yang mengganggu gangguan spesifik spesies herbivor dalam rangkaian rumput tumbuhan dan kesannya terhadap maklumat peribadi tertentu. Analisis ini seterusnya mengesahkan bahawa hubungan rangkaian hormon dalaman dengan hormon tumbuhan lain selain JA membentuk kekhususan penyusunan semula metabolik yang disebabkan oleh herbivor. Khususnya, kami mengesan bahawa ET yang disebabkan oleh OSM adalah jauh lebih besar daripada yang disebabkan oleh OSS1. Mod ini selaras dengan lebih banyak kandungan FAC dalam OSM, yang merupakan syarat yang perlu dan mencukupi untuk mencetuskan letusan ET (48). Dalam konteks interaksi antara tumbuhan dan herbivor, fungsi isyarat ET pada dinamik metabolit spesifik tumbuhan masih sporadis dan hanya menyasarkan satu kumpulan sebatian. Di samping itu, kebanyakan kajian telah menggunakan aplikasi eksogen ET atau prekursornya atau pelbagai perencat untuk mengkaji pengawalaturan ET, antaranya aplikasi kimia eksogen ini akan menghasilkan banyak kesan sampingan yang tidak spesifik. Setahu kami, kajian ini merupakan pemeriksaan sistematik berskala besar pertama tentang peranan ET dalam penggunaan ET untuk menghasilkan dan melihat tumbuhan transgenik yang terjejas untuk menyelaraskan dinamik metabolit tumbuhan. Induksi ET khusus herbivor akhirnya boleh memodulasi tindak balas metabolit. Yang paling ketara ialah manipulasi transgenik gen biosintesis ET (ACO) dan persepsi (ETR1) yang mendedahkan pengumpulan fenolamida de novo khusus herbivor. Sebelum ini telah ditunjukkan bahawa ET boleh menyelaraskan pengumpulan nikotin yang disebabkan oleh JA dengan mengawal selia putresin N-metiltransferase (49). Walau bagaimanapun, dari sudut pandangan mekanikal, tidak jelas bagaimana ET menyelaraskan induksi fenamida. Selain fungsi transduksi isyarat ET, fluks metabolik juga boleh dialihkan kepada S-adenosil-1-metionina untuk mengawal selia pelaburan dalam poliaminofenol amida. S-adenosil-1-metionina ialah ET dan perantaraan biasa bagi laluan biosintetik poliamina. Mekanisme bagaimana isyarat ET mengawal selia tahap fenolamida memerlukan kajian lanjut.
Untuk masa yang lama, disebabkan oleh bilangan metabolit khas yang tidak diketahui strukturnya, perhatian yang mendalam terhadap kategori metabolik tertentu tidak dapat menilai secara ketat perubahan temporal kepelbagaian metabolik selepas interaksi biologi. Pada masa ini, berdasarkan analisis teori maklumat, hasil utama pemerolehan spektrum MS/MS berdasarkan metabolit yang tidak berat sebelah ialah herbivor yang memakan atau mensimulasikan herbivor terus mengurangkan kepelbagaian metabolik keseluruhan metabolit daun sambil meningkatkan tahap pengkhususannya. Peningkatan sementara dalam kekhususan metabolit yang disebabkan oleh herbivor ini dikaitkan dengan peningkatan sinergistik dalam kekhususan transkriptom. Ciri yang paling banyak menyumbang kepada pengkhususan metabolit yang lebih besar ini (mempunyai nilai Si yang lebih tinggi) ialah metabolit khas dengan fungsi herbivor yang dicirikan sebelum ini. Model ini selaras dengan ramalan teori OD, tetapi ramalan MT yang berkaitan dengan kerawakan pengaturcaraan semula metabolit tidak konsisten. Walau bagaimanapun, data ini juga selaras dengan ramalan model campuran (MT terbaik; Rajah 1B), kerana metabolit lain yang tidak dicirikan dengan fungsi pertahanan yang tidak diketahui mungkin masih mengikuti taburan Si rawak.
Satu corak penting yang selanjutnya ditangkap oleh kajian ini ialah dari peringkat mikro-evolusi (populasi tumbuhan tunggal dan tembakau) kepada skala evolusi yang lebih besar (spesies tembakau yang berkait rapat), tahap organisasi evolusi yang berbeza berada dalam "pertahanan terbaik". Terdapat perbezaan yang ketara dalam kebolehan herbivor. Moore et al. (20) dan Kessler dan Kalske (1) secara bebas mencadangkan untuk menukar tiga tahap biodiversiti berfungsi yang asalnya dibezakan oleh Whittaker (50) kepada perubahan temporal kepelbagaian kimia yang konstitutif dan teraruh; penulis ini tidak meringkaskan Prosedur untuk pengumpulan data metabolit berskala besar juga tidak menggariskan cara mengira kepelbagaian metabolik daripada data ini. Dalam kajian ini, pelarasan kecil pada klasifikasi berfungsi Whittaker akan mempertimbangkan kepelbagaian α-metabolik sebagai kepelbagaian spektrum MS/MS dalam tumbuhan tertentu, dan kepelbagaian β-metabolik sebagai metabolisme intraspesifik asas sekumpulan populasi. Ruang, dan kepelbagaian γ-metabolik akan menjadi lanjutan daripada analisis spesies yang serupa.
Isyarat JA adalah penting untuk pelbagai tindak balas metabolik herbivor. Walau bagaimanapun, terdapat kekurangan ujian kuantitatif yang ketat terhadap sumbangan pengawalaturan intraspesifik biosintesis JA kepada kepelbagaian metabolit, dan sama ada isyarat JA merupakan tapak umum untuk kepelbagaian metabolik yang disebabkan oleh tekanan pada skala makroevolusi yang lebih tinggi masih sukar difahami. Kami mendapati bahawa sifat herbivor Nepenthes herbivor mendorong pengkhususan metabolit dan variasi pengkhususan metabolit dalam populasi spesies Nicotiana dan antara spesies Nicotiana yang berkait rapat secara sistematik berkorelasi positif dengan isyarat JA. Di samping itu, apabila isyarat JA terjejas, kekhususan metabolik yang disebabkan oleh herbivor genotip tunggal akan dibatalkan (Rajah 3, C dan E). Memandangkan perubahan spektrum metabolik populasi Nepenthes yang dilemahkan secara semula jadi kebanyakannya kuantitatif, perubahan dalam kepelbagaian dan kekhususan β metabolik dalam analisis ini mungkin sebahagian besarnya disebabkan oleh pengujaan kuat kategori sebatian kaya metabolit. Kelas sebatian ini mendominasi sebahagian daripada profil metabolit dan membawa kepada korelasi positif dengan isyarat JA.
Oleh kerana mekanisme biokimia spesies tembakau yang berkait rapat dengannya sangat berbeza, metabolit dikenal pasti secara khusus dalam aspek kualitatif, jadi ia lebih analitikal. Pemprosesan teori maklumat terhadap profil metabolik yang ditangkap mendedahkan bahawa induksi herbivor memburukkan lagi pertukaran antara kepelbagaian gama metabolik dan pengkhususan. Isyarat JA memainkan peranan penting dalam pertukaran ini. Peningkatan pengkhususan metabolit adalah konsisten dengan ramalan OD utama dan berkorelasi positif dengan isyarat JA, manakala isyarat JA berkorelasi negatif dengan kepelbagaian gama metabolik. Model ini menunjukkan bahawa kapasiti OD tumbuhan terutamanya ditentukan oleh keplastikan JA, sama ada pada skala mikroevolusi atau pada skala evolusi yang lebih besar. Eksperimen aplikasi JA eksogen yang memintas kecacatan biosintesis JA mendedahkan lagi bahawa spesies tembakau yang berkait rapat boleh dibezakan kepada spesies responsif isyarat dan tidak responsif isyarat, sama seperti mod JA dan keplastikan metabolit yang disebabkan oleh herbivor. Spesies tidak responsif isyarat tidak boleh bertindak balas kerana ketidakupayaan mereka untuk menghasilkan JA endogen dan oleh itu tertakluk kepada batasan fisiologi. Ini mungkin disebabkan oleh mutasi dalam beberapa gen utama dalam laluan isyarat JA (AOS dan JAR4 dalam N. crescens). Keputusan ini menunjukkan bahawa corak makroevolusi antara spesies ini mungkin didorong terutamanya oleh perubahan dalam persepsi dan tindak balas hormon dalaman.
Selain interaksi antara tumbuhan dan herbivor, penerokaan kepelbagaian metabolik berkaitan dengan semua kemajuan teori penting dalam penyelidikan penyesuaian biologi terhadap persekitaran dan evolusi sifat fenotip yang kompleks. Dengan peningkatan jumlah data yang diperoleh oleh instrumen MS moden, pengujian hipotesis mengenai kepelbagaian metabolik kini dapat mengatasi perbezaan metabolit individu/kategori dan melakukan analisis global untuk mendedahkan corak yang tidak dijangka. Dalam proses analisis berskala besar, metafora penting adalah idea untuk menghasilkan peta bermakna yang dapat digunakan untuk meneroka data. Oleh itu, hasil penting dari gabungan metabolomik MS/MS yang tidak berat sebelah dan teori maklumat semasa adalah ia menyediakan metrik mudah yang dapat digunakan untuk membina peta untuk melihat kepelbagaian metabolik pada skala taksonomi yang berbeza. Ini adalah keperluan asas kaedah ini. Kajian evolusi mikro/makro dan ekologi komuniti.
Pada peringkat makro-evolusi, teras teori ko-evolusi tumbuhan-serangga Ehrlich dan Raven (51) adalah untuk meramalkan bahawa variasi kepelbagaian metabolik antara spesies adalah punca kepelbagaian keturunan tumbuhan. Walau bagaimanapun, dalam tempoh lima puluh tahun sejak penerbitan karya penting ini, hipotesis ini jarang diuji (52). Ini sebahagian besarnya disebabkan oleh ciri-ciri filogenetik ciri-ciri metabolik yang setanding merentasi keturunan tumbuhan jarak jauh. Kelangkaan ini boleh digunakan untuk menambat kaedah analisis sasaran. Aliran kerja MS/MS semasa yang diproses oleh teori maklumat mengukur persamaan struktur MS/MS metabolit yang tidak diketahui (tanpa pemilihan metabolit terlebih dahulu) dan menukar MS/MS ini kepada satu set MS/MS, justeru dalam metabolisme profesional, model makro-evolusi ini dibandingkan dalam skala pengelasan. Petunjuk statistik mudah. ​​Proses ini serupa dengan analisis filogenetik, yang boleh menggunakan penjajaran urutan untuk mengukur kadar kepelbagaian atau evolusi watak tanpa ramalan terlebih dahulu.
Pada peringkat biokimia, hipotesis penyaringan Firn dan Jones (53) menunjukkan bahawa kepelbagaian metabolik dikekalkan pada tahap yang berbeza untuk menyediakan bahan mentah bagi menjalankan aktiviti biologi metabolit yang sebelum ini tidak berkaitan atau digantikan. Kaedah teori maklumat menyediakan rangka kerja di mana peralihan evolusi khusus metabolit ini yang berlaku semasa pengkhususan metabolit boleh diukur sebagai sebahagian daripada proses penyaringan evolusi yang dicadangkan: penyesuaian aktif secara biologi daripada kekhususan rendah kepada kekhususan tinggi Metabolit yang terhalang daripada persekitaran tertentu.
Secara keseluruhannya, pada zaman awal biologi molekul, teori pertahanan tumbuhan yang penting telah dibangunkan, dan kaedah deduktif yang dipacu hipotesis secara meluas dianggap sebagai satu-satunya cara kemajuan saintifik. Ini sebahagian besarnya disebabkan oleh batasan teknikal dalam mengukur keseluruhan metabolit. Walaupun kaedah yang dipacu hipotesis amat berguna dalam memilih mekanisme kausal lain, keupayaannya untuk memajukan pemahaman kita tentang rangkaian biokimia adalah lebih terhad daripada kaedah pengiraan yang terdapat pada masa ini dalam sains intensif data kontemporari. Oleh itu, teori yang tidak dapat diramalkan adalah jauh di luar skop data yang ada, jadi formula/kitaran ujian hipotesis kemajuan dalam bidang penyelidikan tidak dapat dihapuskan (4). Kami menjangkakan bahawa aliran kerja pengiraan metabolomik yang diperkenalkan di sini dapat menghidupkan semula minat dalam isu (bagaimana) dan akhir (mengapa) kepelbagaian metabolik terkini, dan menyumbang kepada era baharu sains data berpandukan teori. Era ini mengkaji semula teori-teori penting yang memberi inspirasi kepada generasi sebelumnya.
Pemberian makanan herbivor secara langsung dijalankan dengan membesarkan larva instar kedua atau larva Sl pada satu daun periuk kera berwarna pucat daripada satu tumbuhan berbunga mawar, dengan 10 replika tumbuhan setiap tumbuhan. Larva serangga diapit dengan pengapit, dan tisu daun yang tinggal dikumpulkan 24 dan 72 jam selepas jangkitan dan dibekukan dengan cepat, dan metabolitnya diekstrak.
Simulasikan rawatan herbivor dengan cara yang sangat serentak. Kaedahnya adalah dengan menggunakan roda corak fabrik untuk menebuk tiga baris duri pada setiap sisi tulang rusuk tiga daun tumbuhan yang telah mengembang sepenuhnya semasa peringkat pertumbuhan kalungan fabrik, dan segera sapukan 1:5 Ms yang telah dicairkan. Atau gunakan jari yang memakai sarung tangan untuk memasukkan S1 OS ke dalam luka tebuk. Tuai dan proseskan daun seperti yang diterangkan di atas. Gunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini untuk mengekstrak metabolit primer dan hormon tumbuhan (54).
Untuk aplikasi JA eksogen, tiga daun tangkai daun bagi setiap enam tumbuhan berbunga mawar bagi setiap spesies dirawat dengan 20μl pes lanolin yang mengandungi 150μg MeJA (Lan + MeJA), dan 20μl lanolin serta rawatan luka (Lan + W), atau gunakan 20μl lanolin tulen sebagai kawalan. Daun dituai 72 jam selepas rawatan, dibekukan dalam nitrogen cecair, dan disimpan pada suhu -80°C sehingga digunakan.
Empat baris transgenik JA dan ET, iaitu irAOC (36), irCOI1 (55), irACO dan sETR1 (48), telah dikenal pasti dalam kumpulan penyelidikan kami. irAOC menunjukkan penurunan yang ketara dalam tahap JA dan JA-Ile, manakala irCOI1 tidak sensitif terhadap JA. Berbanding dengan EV, pengumpulan JA-Ile meningkat. Begitu juga, irACO akan mengurangkan pengeluaran ET, dan berbanding dengan EV, sETR1, yang tidak sensitif terhadap ET, akan meningkatkan pengeluaran ET.
Spektrometer laser fotoakustik (sensor ET masa nyata Sensor Sense ETD-300) digunakan untuk melakukan pengukuran ET secara bukan invasif. Sejurus selepas rawatan, separuh daripada daun dipotong dan dipindahkan ke dalam vial kaca 4 ml yang tertutup rapat, dan ruang atas dibiarkan terkumpul dalam masa 5 jam. Semasa pengukuran, setiap vial dibilas dengan aliran udara tulen sebanyak 2 liter/jam selama 8 minit, yang sebelum ini telah melalui mangkin yang disediakan oleh Sensor Sense untuk menyingkirkan CO2 dan air.
Data mikroarray pada asalnya diterbitkan dalam (35) dan disimpan dalam Pangkalan Data Komprehensif Ekspresi Gen Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan (NCBI) (nombor penyertaan GSE30287). Data yang sepadan dengan daun yang disebabkan oleh rawatan W + OSM dan kawalan yang tidak rosak telah diekstrak untuk kajian ini. Keamatan mentah ialah log2. Sebelum analisis statistik, garis dasar ditukar dan dinormalisasikan kepada persentil ke-75 menggunakan pakej perisian R.
Data penjujukan RNA asal (RNA-seq) spesies Nicotiana telah diambil daripada Arkib Bacaan Ringkas NCBI (SRA), nombor projek ialah PRJNA301787, yang dilaporkan oleh Zhou et al. (39) dan diteruskan seperti yang diterangkan dalam (56). Data mentah yang diproses oleh W + W, W + OSM dan W + OSS1 yang sepadan dengan spesies Nicotiana telah dipilih untuk analisis dalam kajian ini, dan diproses dengan cara berikut: Pertama, bacaan RNA-seq mentah telah ditukar kepada format FASTQ. HISAT2 menukar FASTQ kepada SAM, dan SAMtools menukar fail SAM kepada fail BAM yang disusun. StringTie digunakan untuk mengira ekspresi gen, dan kaedah ekspresinya ialah terdapat serpihan bagi setiap seribu serpihan asas bagi setiap juta serpihan transkripsi yang dijujukan.
Lajur kromatografi Acclaim (150 mm x 2.1 mm; saiz zarah 2.2μm) yang digunakan dalam analisis dan lajur pengawal 4 mm x 4 mm terdiri daripada bahan yang sama. Kecerunan binari berikut digunakan dalam sistem Kromatografi Cecair Prestasi Ultra Tinggi Dionex UltiMate 3000 (UHPLC): 0 hingga 0.5 minit, isokratik 90% A [air deionisasi, 0.1% (v/v) asetonitril dan 0.05% asid formik], 10% B (Asetonitril dan 0.05% asid formik); 0.5 hingga 23.5 minit, fasa kecerunan masing-masing ialah 10% A dan 90% B; 23.5 hingga 25 minit, isokratik 10% A dan 90% B. Kadar aliran ialah 400μl/min. Untuk semua analisis MS, suntikan eluen lajur ke dalam penganalisis kuadrupol dan masa penerbangan (qTOF) yang dilengkapi dengan sumber elektrosemburan yang beroperasi dalam mod pengionan positif (voltan kapilari, 4500 V; saluran keluar kapilari 130 V; Suhu pengeringan 200°C; aliran udara pengeringan 10 liter/min).
Lakukan analisis serpihan MS / MS (selepas ini dirujuk sebagai MS / MS) yang tidak relevan atau tidak dapat dibezakan daripada data untuk mendapatkan maklumat struktur tentang profil metabolik keseluruhan yang boleh dikesan. Konsep kaedah MS/MS yang tidak jelas bergantung pada fakta bahawa quadrupole mempunyai tetingkap pengasingan jisim yang sangat besar [oleh itu, pertimbangkan semua isyarat nisbah jisim-ke-cas (m/z) sebagai serpihan]. Atas sebab ini, kerana instrumen Impact II tidak dapat mencipta kecondongan CE, beberapa analisis bebas telah dilakukan menggunakan nilai tenaga perlanggaran (CE) penceraian yang disebabkan oleh perlanggaran yang meningkat. Pendek kata, analisis sampel terlebih dahulu melalui pengionan elektrosemburan UHPLC/qTOF-MS menggunakan mod spektrometri jisim tunggal (keadaan pemecahan rendah yang dijana oleh pemecahan dalam sumber), pengimbasan dari m/z 50 hingga 1500 pada frekuensi pengulangan 5 Hz. Gunakan nitrogen sebagai gas perlanggaran untuk analisis MS/MS, dan lakukan pengukuran bebas pada empat voltan penceraian yang disebabkan oleh perlanggaran yang berbeza berikut: 20, 30, 40, dan 50 eV. Sepanjang proses pengukuran, kuadrupole mempunyai tetingkap pengasingan jisim terbesar, dari m/z 50 hingga 1500. Apabila badan hadapan m/z dan eksperimen lebar pengasingan ditetapkan kepada 200, julat jisim diaktifkan secara automatik oleh perisian pengendalian instrumen dan 0 Da. Imbas serpihan jisim seperti dalam mod jisim tunggal. Gunakan natrium format (50 ml isopropanol, 200 μl asid formik dan 1 ml 1M larutan akueus NaOH) untuk penentukuran jisim. Menggunakan algoritma penentukuran ketepatan tinggi Bruker, fail data dikalibrasi selepas menjalankan spektrum purata dalam tempoh masa tertentu. Gunakan fungsi eksport perisian Analisis Data v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Jerman) untuk menukar fail data mentah kepada format NetCDF. Set data MS/MS telah disimpan dalam pangkalan data metabolomik terbuka MetaboLights (www.ebi.ac.uk) dengan nombor aksesi. MTBLS1471.
Perhimpunan MS/MS boleh direalisasikan melalui analisis korelasi antara isyarat kualiti MS1 dan MS/MS untuk tenaga perlanggaran rendah dan tinggi serta peraturan yang baru dilaksanakan. Skrip R digunakan untuk merealisasikan analisis korelasi taburan prekursor kepada produk, dan skrip C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) digunakan untuk melaksanakan peraturan.
Untuk mengurangkan ralat positif palsu yang disebabkan oleh hingar latar belakang dan korelasi palsu yang disebabkan oleh pengesanan ciri m/z tertentu hanya dalam beberapa sampel, kami menggunakan fungsi "puncak terisi" bagi pakej R XCMS (untuk pembetulan hingar latar belakang). Ia harus digunakan untuk menggantikan keamatan "NA" (puncak tidak dikesan). Apabila fungsi puncak terisi digunakan, masih terdapat banyak nilai keamatan "0" dalam set data yang akan mempengaruhi pengiraan korelasi. Kemudian, kami membandingkan hasil pemprosesan data yang diperoleh apabila fungsi puncak terisi digunakan dan apabila fungsi puncak terisi tidak digunakan, dan mengira nilai hingar latar belakang berdasarkan nilai anggaran purata yang dibetulkan, dan kemudian menggantikan nilai keamatan 0 ini dengan nilai latar belakang yang dikira. Kami juga hanya mempertimbangkan ciri yang keamatannya melebihi tiga kali ganda nilai latar belakang dan menganggapnya sebagai "puncak sebenar." Untuk pengiraan PCC, hanya isyarat m/z bagi prekursor sampel (MS1) dan set data serpihan dengan sekurang-kurangnya lapan puncak sebenar dipertimbangkan.
Jika keamatan ciri kualiti prekursor dalam keseluruhan sampel berkorelasi secara signifikan dengan keamatan yang dikurangkan bagi ciri kualiti yang sama yang tertakluk kepada tenaga perlanggaran rendah atau tinggi, dan ciri tersebut tidak dilabelkan sebagai puncak isotop oleh CAMERA, ia boleh ditakrifkan lebih lanjut. Kemudian, dengan mengira semua pasangan prekursor-produk yang mungkin dalam tempoh 3 s (tetingkap masa pengekalan anggaran untuk pengekalan puncak), analisis korelasi dilakukan. Hanya apabila nilai m/z lebih rendah daripada nilai prekursor dan pemecahan MS/MS berlaku di lokasi sampel yang sama dalam set data seperti prekursor dari mana ia diperoleh, barulah ia dianggap sebagai serpihan.
Berdasarkan dua peraturan mudah ini, kami mengecualikan serpihan yang ditentukan dengan nilai m/z yang lebih besar daripada m/z bagi prekursor yang dikenal pasti, dan berdasarkan kedudukan sampel di mana prekursor muncul dan serpihan yang ditentukan. Ia juga mungkin untuk memilih ciri kualiti yang dihasilkan oleh banyak serpihan dalam sumber yang dihasilkan dalam mod MS1 sebagai prekursor calon, sekali gus menghasilkan sebatian MS/MS yang berlebihan. Untuk mengurangkan redundansi data ini, jika persamaan NDP spektrum melebihi 0.6, dan ia tergolong dalam kromatogram "pcgroup" yang dianotasi oleh CAMERA, kami akan menggabungkannya. Akhir sekali, kami menggabungkan keempat-empat keputusan CE yang berkaitan dengan prekursor dan serpihan ke dalam spektrum komposit terdekonvolusi akhir dengan memilih puncak keamatan tertinggi antara semua puncak calon dengan nilai m/z yang sama pada tenaga perlanggaran yang berbeza. Langkah pemprosesan seterusnya adalah berdasarkan konsep spektrum komposit dan mengambil kira keadaan CE berbeza yang diperlukan untuk memaksimumkan kebarangkalian pemecahan, kerana sesetengah serpihan hanya boleh dikesan di bawah tenaga perlanggaran tertentu.
RDPI (30) telah digunakan untuk mengira kebolehinduksian profil metabolik. Kepelbagaian spektrum metabolik (indeks Hj) diperoleh daripada kelimpahan prekursor MS/MS menggunakan entropi Shannon bagi taburan frekuensi MS/MS menggunakan persamaan berikut yang diterangkan oleh Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) yang mana Pij sepadan dengan frekuensi relatif MS/MS ke-i dalam sampel ke-j (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m)t).
Kekhususan metabolik (indeks Si) ditakrifkan sebagai identiti ekspresi MS/MS yang diberikan berhubung dengan frekuensi antara sampel yang dipertimbangkan. Kekhususan MS/MS dikira sebagai Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Gunakan formula berikut untuk mengukur indeks δj khusus metabolit bagi setiap sampel j, dan purata kekhususan MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Spektrum MS/MS diselaraskan secara berpasangan, dan persamaan dikira berdasarkan dua skor tersebut. Pertama, menggunakan NDP standard (juga dikenali sebagai kaedah korelasi kosinus), gunakan persamaan berikut untuk menjaringkan persamaan segmen antara spektrum NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 dengan S1 dan S2. Sejajar dengan itu, untuk spektrum 1 dan spektrum 2, serta WS1, i dan WS2, i mewakili pemberat berdasarkan keamatan puncak bahawa perbezaan puncak sepunya ke-i antara kedua-dua spektrum adalah kurang daripada 0.01 Da. Pemberat dikira seperti berikut: W = [keamatan puncak] m [kualiti] n, m = 0.5, n = 2, seperti yang dicadangkan oleh MassBank.
Kaedah pemarkahan kedua telah dilaksanakan, yang melibatkan analisis NL yang dikongsi antara MS/MS. Untuk tujuan ini, kami menggunakan 52 senarai NL yang kerap ditemui semasa proses pemecahan MS secara serentak, dan NL yang lebih spesifik (fail data S1) yang telah dianotasi sebelum ini untuk spektrum MS/MS metabolit sekunder spesies Nepenthes yang lemah (9, 26). Cipta vektor binari 1 dan 0 untuk setiap MS/MS, masing-masing sepadan dengan semasa dan ketiadaan sesetengah NL. Berdasarkan persamaan jarak Euclidean, skor persamaan NL dikira untuk setiap pasangan vektor NL binari.
Untuk melaksanakan pengelompokan dwi, ​​kami menggunakan pakej R DiffCoEx, yang berdasarkan lanjutan Analisis Ekspresi Gen Berwajaran (WGCNA). Menggunakan matriks pemarkahan NDP dan NL bagi spektrum MS/MS, kami menggunakan DiffCoEx untuk mengira matriks korelasi perbandingan. Pengelompokan binari dilakukan dengan menetapkan parameter "cutreeDynamic" kepada kaedah = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, dan minClusterSize = 10. Kod sumber R DiffCoEx telah dimuat turun daripada fail tambahan 1 oleh Tesson et al. (57); Pakej perisian R WGCNA yang diperlukan boleh didapati di https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Untuk melaksanakan analisis rangkaian molekul MS/MS, kami mengira ketersambungan spektrum berpasangan berdasarkan jenis persamaan NDP dan NL, dan menggunakan perisian Cytoscape untuk menggambarkan topologi rangkaian menggunakan susun atur organik dalam aplikasi peluasan algoritma susun atur yFiles CyFilescape.
Gunakan R versi 3.0.1 untuk menjalankan analisis statistik ke atas data. Kepentingan statistik dinilai menggunakan analisis varians dua hala (ANOVA), diikuti dengan ujian post-hoc perbezaan ketara Tukey (HSD). Untuk menganalisis perbezaan antara rawatan herbivor dan kawalan, taburan dua hujung bagi dua kumpulan sampel dengan varians yang sama dianalisis menggunakan ujian t Student.
Untuk bahan tambahan bagi artikel ini, sila lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Ini merupakan artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah terma Lesen Creative Commons Atribusi-Bukan-Komersial, yang membenarkan penggunaan, pengedaran dan penghasilan semula dalam sebarang medium, selagi penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah karya asal adalah betul. Rujukan.
Nota: Kami hanya meminta anda memberikan alamat e-mel anda supaya orang yang anda cadangkan ke halaman tersebut tahu bahawa anda mahu mereka melihat e-mel tersebut dan ia bukan spam. Kami tidak akan merekodkan sebarang alamat e-mel.
Soalan ini digunakan untuk menguji sama ada anda seorang pelawat dan mencegah penyerahan spam automatik.
Teori maklumat menyediakan mata wang universal untuk perbandingan metabolit khas dan ramalan teori pertahanan ujian.
Teori maklumat menyediakan mata wang universal untuk perbandingan metabolit khas dan ramalan teori pertahanan ujian.
©2021 American Association for the Advancement of Science. semua hak terpelihara. AAAS ialah rakan kongsi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.