Artikel ini merupakan sebahagian daripada topik penyelidikan “Meningkatkan daya tahan kekacang terhadap patogen dan perosak”, lihat semua 5 artikel
Agen penyebab nekrosis penyakit tumbuhan kulat Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary menggunakan strategi berbilang peringkat untuk menjangkiti tumbuhan perumah yang berbeza. Kajian ini mencadangkan penggunaan diamina L-ornitin, asid amino bukan protein yang merangsang sintesis asid amino penting lain, sebagai strategi pengurusan alternatif untuk meningkatkan tindak balas molekul, fisiologi dan biokimia Phaseolus vulgaris L. terhadap kulat putih yang disebabkan oleh Pseudomonas sclerotiorum. Eksperimen in vitro menunjukkan bahawa L-ornitin dengan ketara menghalang pertumbuhan miselium S. pyrenoidosa dengan cara yang bergantung kepada dos. Selain itu, ia boleh mengurangkan keterukan kulat putih dengan ketara di bawah keadaan rumah hijau. Tambahan pula, L-ornitin merangsang pertumbuhan tumbuhan yang dirawat, menunjukkan bahawa kepekatan L-ornitin yang diuji tidak fitotoksik kepada tumbuhan yang dirawat. Di samping itu, L-ornitin meningkatkan ekspresi antioksidan bukan enzimatik (jumlah fenolik dan flavonoid larut) dan antioksidan enzimatik (katalase (CAT), peroksidase (POX), dan polifenol oksidase (PPO)), dan meningkatkan ekspresi tiga gen berkaitan antioksidan (PvCAT1, PvSOD, dan PvGR). Tambahan pula, analisis in silico mendedahkan kehadiran protein oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) putatif dalam genom S. sclerotiorum, yang sangat serupa dengan protein oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) dan Penicillium sp. (PlOAH) dari segi analisis fungsi, domain terpelihara, dan topologi. Menariknya, penambahan L-ornitin kepada medium sup dekstrosa kentang (PDB) dengan ketara mengurangkan ekspresi gen SsOAH dalam miselia S. sclerotiorum. Begitu juga, aplikasi eksogen L-ornitin mengurangkan ekspresi gen SsOAH dengan ketara dalam miselia kulat yang dikumpulkan daripada tumbuhan yang dirawat. Akhir sekali, aplikasi L-ornitin mengurangkan rembesan asid oksalik dengan ketara dalam kedua-dua medium PDB dan daun yang dijangkiti. Kesimpulannya, L-ornitin memainkan peranan penting dalam mengekalkan status redoks serta meningkatkan tindak balas pertahanan tumbuhan yang dijangkiti. Hasil kajian ini boleh membantu dalam membangunkan kaedah inovatif dan mesra alam untuk mengawal kulat putih dan mengurangkan kesannya terhadap pengeluaran kacang dan tanaman lain.
Kulat putih, yang disebabkan oleh kulat nekrotropik Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, merupakan penyakit yang dahsyat dan mengurangkan hasil yang menimbulkan ancaman serius kepada pengeluaran kacang global (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum merupakan salah satu patogen tumbuhan kulat bawaan tanah yang paling sukar dikawal, dengan julat perumah yang luas iaitu lebih 600 spesies tumbuhan dan keupayaan untuk membasmi tisu perumah dengan cepat secara tidak spesifik (Liang dan Rollins, 2018). Di bawah keadaan yang tidak baik, ia mengalami fasa kritikal kitaran hayatnya, kekal tidak aktif untuk jangka masa yang lama sebagai struktur hitam, keras, seperti biji yang dipanggil 'sclerotia' di dalam tanah atau sebagai pertumbuhan putih dan gebu dalam miselium atau empulur batang tumbuhan yang dijangkiti (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum mampu membentuk sklerotia, yang membolehkannya hidup di ladang yang dijangkiti untuk jangka masa yang lama dan berterusan semasa penyakit (Schwartz et al., 2005). Sklerotia kaya dengan nutrien, boleh bertahan di dalam tanah untuk jangka masa yang lama, dan berfungsi sebagai inokulum utama untuk jangkitan berikutnya (Schwartz et al., 2005). Di bawah keadaan yang baik, sklerotia bercambah dan menghasilkan spora bawaan udara yang boleh menjangkiti semua bahagian tumbuhan di atas tanah, termasuk tetapi tidak terhad kepada bunga, batang, atau polong (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum menggunakan strategi berbilang peringkat untuk menjangkiti tumbuhan perumahnya, yang melibatkan satu siri peristiwa terselaras daripada percambahan sklerotial hingga perkembangan gejala. Pada mulanya, S. sclerotiorum menghasilkan spora terampai (dipanggil askospora) daripada struktur seperti cendawan yang dipanggil apothecia, yang menjadi bawaan udara dan berkembang menjadi sklerotia tidak bergerak pada serpihan tumbuhan yang dijangkiti (Bolton et al., 2006). Kulat kemudiannya merembeskan asid oksalik, faktor virulensi, untuk mengawal pH dinding sel tumbuhan, menggalakkan degradasi enzimatik dan pencerobohan tisu (Hegedus dan Rimmer, 2005), dan menyekat letupan oksidatif tumbuhan perumah. Proses pengasidan ini melemahkan dinding sel tumbuhan, menyediakan persekitaran yang baik untuk operasi enzim penguraian dinding sel kulat (CWDE) yang normal dan cekap, membolehkan patogen mengatasi penghalang fizikal dan menembusi tisu perumah (Marciano et al., 1983). Setelah ditembusi, S. sclerotiorum merembeskan beberapa CWDE, seperti poligalakturonase dan selulase, yang memudahkan penyebarannya dalam tisu yang dijangkiti dan menyebabkan nekrosis tisu. Perkembangan lesi dan tikar hifa membawa kepada gejala ciri kulat putih (Hegedus dan Rimmer, 2005). Sementara itu, tumbuhan perumah mengenali corak molekul berkaitan patogen (PAMP) melalui reseptor pengecaman corak (PRR), mencetuskan satu siri peristiwa isyarat yang akhirnya mengaktifkan tindak balas pertahanan.
Walaupun terdapat beberapa dekad usaha kawalan penyakit, kekurangan plasma nutfah tahan yang mencukupi masih kekal dalam kacang, seperti dalam tanaman komersial lain, disebabkan oleh rintangan, kemandirian, dan kebolehsuaian patogen. Oleh itu, pengurusan penyakit sangat mencabar dan memerlukan strategi bersepadu dan pelbagai rupa yang merangkumi gabungan amalan budaya, kawalan biologi, dan racun kulat kimia (O'Sullivan et al., 2021). Kawalan kimia terhadap kulat putih adalah yang paling berkesan kerana racun kulat, apabila digunakan dengan betul dan pada masa yang tepat, dapat mengawal penyebaran penyakit dengan berkesan, mengurangkan keterukan jangkitan, dan meminimumkan kehilangan hasil. Walau bagaimanapun, penggunaan berlebihan dan pergantungan berlebihan pada racun kulat boleh menyebabkan kemunculan strain S. sclerotiorum yang tahan dan memberi kesan negatif kepada organisma bukan sasaran, kesihatan tanah, dan kualiti air (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Oleh itu, mencari alternatif yang mesra alam telah menjadi keutamaan utama.
Poliamina (PA), seperti putresin, spermidin, spermina dan kadaverin, boleh berfungsi sebagai alternatif yang menjanjikan terhadap patogen tumbuhan bawaan tanah, sekali gus mengurangkan sepenuhnya atau sebahagian penggunaan racun kulat kimia berbahaya (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Dalam tumbuhan yang lebih tinggi, PA terlibat dalam banyak proses fisiologi termasuk, tetapi tidak terhad kepada, pembahagian sel, pembezaan dan tindak balas terhadap tekanan abiotik dan biotik (Killiny dan Nehela, 2020). Mereka boleh bertindak sebagai antioksidan, membantu mengumpul spesies oksigen reaktif (ROS), mengekalkan homeostasis redoks (Nehela dan Killiny, 2023), mendorong gen berkaitan pertahanan (Romero et al., 2018), mengawal selia pelbagai laluan metabolik (Nehela dan Killiny, 2023), memodulasi fitohormon endogen (Nehela dan Killiny, 2019), mewujudkan rintangan diperoleh sistemik (SAR), dan mengawal selia interaksi tumbuhan-patogen (Nehela dan Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Perlu diingatkan bahawa mekanisme dan peranan khusus PA dalam pertahanan tumbuhan berbeza-beza bergantung pada spesies tumbuhan, patogen dan keadaan persekitaran. PA yang paling banyak dalam tumbuhan dibiosintesis daripada poliamina penting L-ornitin (Killiny dan Nehela, 2020).
L-ornitin memainkan pelbagai peranan dalam pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan. Sebagai contoh, kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa dalam padi (Oryza sativa), ornitin mungkin dikaitkan dengan kitar semula nitrogen (Liu et al., 2018), hasil padi, kualiti dan aroma (Lu et al., 2020), dan tindak balas tekanan air (Yang et al., 2000). Tambahan pula, penggunaan L-ornitin secara eksogen meningkatkan toleransi kemarau dengan ketara dalam bit gula (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) dan mengurangkan tekanan garam dalam tumbuhan bawang (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu dan Çavuşoǧlu, 2021) dan gajus (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Potensi peranan L-ornitin dalam pertahanan tekanan abiotik mungkin disebabkan oleh penglibatannya dalam pengumpulan prolin dalam tumbuhan yang dirawat. Sebagai contoh, gen yang berkaitan dengan metabolisme prolin, seperti gen ornitin delta aminotransferase (delta-OAT) dan prolin dehidrogenase (ProDH1 dan ProDH2), sebelum ini telah dilaporkan terlibat dalam pertahanan Nicotiana benthamiana dan Arabidopsis thaliana terhadap strain Pseudomonas syringae bukan perumah (Senthil-Kumar dan Mysore, 2012). Sebaliknya, ornitin dekarboksilase kulat (ODC) diperlukan untuk pertumbuhan patogen (Singh et al., 2020). Penyasaran ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici melalui pembungkaman gen yang disebabkan oleh perumah (HIGS) dengan ketara meningkatkan daya tahan tumbuhan tomato terhadap layu Fusarium (Singh et al., 2020). Walau bagaimanapun, potensi peranan aplikasi ornitin eksogen terhadap tekanan biotik seperti fitopatogen belum dikaji dengan baik. Lebih penting lagi, kesan ornitin terhadap rintangan penyakit dan fenomena biokimia dan fisiologi yang berkaitan masih belum diterokai.
Memahami kerumitan jangkitan S. sclerotiorum pada kekacang adalah penting untuk pembangunan strategi kawalan yang berkesan. Dalam kajian ini, kami bertujuan untuk mengenal pasti potensi peranan diamina L-ornitin sebagai faktor utama dalam meningkatkan mekanisme pertahanan dan rintangan tumbuhan kekacang terhadap jangkitan Sclerotinia sclerotiorum. Kami membuat hipotesis bahawa, selain meningkatkan tindak balas pertahanan tumbuhan yang dijangkiti, L-ornitin juga memainkan peranan penting dalam mengekalkan status redoks. Kami mencadangkan bahawa potensi kesan L-ornitin berkaitan dengan pengawalaturan mekanisme pertahanan antioksidan enzimatik dan bukan enzimatik dan gangguan terhadap faktor patogenisiti/virulensi kulat dan protein yang berkaitan. Fungsi ganda L-ornitin ini menjadikannya calon yang menjanjikan untuk strategi yang mampan untuk mengurangkan kesan kulat putih dan meningkatkan rintangan tanaman kekacang biasa terhadap patogen kulat yang kuat ini. Hasil kajian ini dapat membantu dalam pembangunan kaedah inovatif dan mesra alam untuk mengawal kulat putih dan mengurangkan kesannya terhadap pengeluaran kekacang.
Dalam kajian ini, varieti komersial kacang biasa yang mudah terdedah, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), telah digunakan sebagai bahan eksperimen. Benih yang sihat telah disediakan oleh Jabatan Penyelidikan Kekacang, Institut Penyelidikan Tanaman Ladang (FCRI), Pusat Penyelidikan Pertanian (ARC), Mesir. Lima biji benih telah disemai dalam pasu plastik (diameter dalam 35 cm, kedalaman 50 cm) yang diisi dengan tanah yang dijangkiti S. sclerotiorum di bawah keadaan rumah hijau (25 ± 2 °C, kelembapan relatif 75 ± 1%, 8 jam terang/16 jam gelap). Pada 7–10 hari selepas menyemai (DPS), anak benih telah dijinakkan untuk meninggalkan hanya dua anak benih dengan pertumbuhan seragam dan tiga daun yang mengembang sepenuhnya dalam setiap pasu. Semua tumbuhan pasu disiram sekali setiap dua minggu dan dibaja setiap bulan pada kadar yang disyorkan untuk varieti yang diberikan.
Untuk menyediakan kepekatan 500 mg/L L-ornitindiamina (juga dikenali sebagai asid (+)-(S)-2,5-diaminopentanoik; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman), 50 mg dilarutkan terlebih dahulu dalam 100 mL air suling steril. Larutan stok kemudiannya dicairkan dan digunakan dalam eksperimen berikutnya. Secara ringkas, enam siri kepekatan L-ornitin (12.5, 25, 50, 75, 100, dan 125 mg/L) telah diuji secara in vitro. Di samping itu, air suling steril telah digunakan sebagai kawalan negatif (Mock) dan serbuk boleh basah 50% racun kulat komersial “Rizolex-T” (toclofos-metil 20% + thiram 30%; Syarikat Pestisid dan Bahan Kimia El Zayat KZ-Kafr, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Mesir) telah digunakan sebagai kawalan positif. Fungisida komersial “Rizolex-T” telah diuji secara in vitro pada lima kepekatan (2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L).
Sampel batang dan polong kacang biasa yang menunjukkan simptom tipikal kulat putih (kadar serangan: 10–30%) telah dikumpulkan dari ladang komersial. Walaupun kebanyakan bahan tumbuhan yang dijangkiti dikenal pasti mengikut spesies/varieti (varieti komersial yang mudah terdedah Giza 3), yang lain, terutamanya yang diperoleh dari pasar tempatan, adalah daripada spesies yang tidak diketahui. Bahan yang dijangkiti yang dikumpulkan terlebih dahulu dibasmi kuman permukaan dengan larutan natrium hipoklorit 0.5% selama 3 minit, kemudian dibilas beberapa kali dengan air suling steril dan dilap kering dengan kertas penapis steril untuk membuang lebihan air. Organ yang dijangkiti kemudiannya dipotong menjadi kepingan kecil dari tisu tengah (antara tisu yang sihat dan yang dijangkiti), dikultur pada medium agar dekstrosa kentang (PDA) dan diinkubasi pada suhu 25 ± 2 °C dengan kitaran cahaya 12 jam/gelap 12 jam selama 5 hari untuk merangsang pembentukan sklerotia. Kaedah hujung miselium juga digunakan untuk menulenkan isolat kulat daripada kultur campuran atau tercemar. Isolat kulat yang ditulenkan pertama kali dikenal pasti berdasarkan ciri morfologi kulturnya dan kemudian disahkan sebagai S. sclerotiorum berdasarkan ciri mikroskopik. Akhir sekali, semua isolat yang telah ditulenkan telah diuji untuk patogenisiti pada kultivar kacang biasa yang mudah terdedah, Giza 3, untuk memenuhi postulat Koch.
Di samping itu, isolat S. sclerotiorum yang paling invasif (isolat #3) telah disahkan selanjutnya berdasarkan penjujukan spacer transkripsi dalaman (ITS) seperti yang diterangkan oleh White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Secara ringkas, isolat telah dikultur dalam sup dekstrosa kentang (PDB) dan diinkubasi pada suhu 25 ± 2 °C selama 5–7 hari. Miselium kulat kemudiannya dikumpulkan, ditapis melalui kain kasa, dibasuh dua kali dengan air steril, dan dikeringkan dengan kertas penapis steril. DNA genomik telah diasingkan menggunakan Kit Miniprep Fungal/Bacterial Quick-DNA™ (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Kawasan rDNA ITS kemudiannya dikuatkan menggunakan pasangan primer khusus ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; saiz jangkaan: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Produk PCR yang telah ditulenkan telah dihantar untuk penjujukan (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Jujukan rDNA ITS telah dijujukan secara dwiarah menggunakan kaedah penjujukan Sanger. Jujukan pertanyaan yang telah dipasang kemudiannya dibandingkan dengan data terkini dalam GenBank dan Pusat Kebangsaan untuk Maklumat Bioteknologi (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) menggunakan perisian BLASTn. Jujukan pertanyaan telah dibandingkan dengan 20 strain/isolat S. sclerotiorum lain yang diambil daripada data terkini dalam NCBI GenBank (Jadual Tambahan S1) menggunakan ClustalW dalam Pakej Analisis Genetik Evolusi Molekul (MEGA-11; versi 11) (Kumar et al., 2024). Analisis evolusi telah dijalankan menggunakan kaedah kemungkinan maksimum dan model penggantian nukleotida boleh balik masa umum (Nei dan Kumar, 2000). Pokok dengan kemungkinan log tertinggi ditunjukkan. Pokok awal untuk carian heuristik dipilih dengan memilih pokok dengan kemungkinan log yang lebih tinggi antara pokok penyambungan jiran (NJ) (Kumar et al., 2024) dan pokok parsimoni maksimum (MP). Pokok NJ dibina menggunakan matriks jarak berpasangan yang dikira menggunakan model boleh balik masa umum (Nei dan Kumar, 2000).
Aktiviti antibakteria L-ornitin dan bakteria "Rizolex-T" ditentukan secara in vitro melalui kaedah resapan agar. Kaedah: Ambil jumlah larutan stok L-ornitin (500 mg/L) yang sesuai dan campurkan dengan teliti dengan 10 ml medium nutrien PDA untuk menyediakan larutan dengan kepekatan akhir masing-masing 12.5, 25, 50, 75, 100 dan 125 mg/L. Lima kepekatan racun kulat "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L) dan air suling steril digunakan sebagai kawalan. Selepas medium memejal, palam miselium kultur Sclerotinia sclerotiorum yang baru disediakan, berdiameter 4 mm, dipindahkan ke tengah piring Petri dan dikultur pada suhu 25±2°C sehingga miselium menutupi keseluruhan piring Petri kawalan, selepas itu pertumbuhan kulat direkodkan. Kira peratusan perencatan pertumbuhan jejari S. sclerotiorum menggunakan persamaan 1:
Eksperimen ini diulang dua kali, dengan enam replika biologi untuk setiap kumpulan kawalan/eksperimen dan lima pasu (dua tumbuhan setiap pasu) untuk setiap replika biologi. Setiap replika biologi dianalisis dua kali (dua replika teknikal) untuk memastikan ketepatan, kebolehpercayaan dan kebolehulangan keputusan eksperimen. Di samping itu, analisis regresi probit digunakan untuk mengira kepekatan perencatan separuh maksimum (IC50) dan IC99 (Prentice, 1976).
Untuk menilai potensi L-ornitin di bawah keadaan rumah hijau, dua eksperimen pasu berturut-turut telah dijalankan. Secara ringkas, pasu diisi dengan tanah liat-pasir yang disterilkan (3:1) dan diinokulasi dengan kultur S. sclerotiorum yang baru disediakan. Pertama, isolat S. sclerotiorum yang paling invasif (isolat #3) dikultur dengan memotong satu sklerotium menjadi dua, meletakkannya menghadap ke bawah di atas PDA dan mengeram pada suhu 25°C dalam kegelapan berterusan (24 jam) selama 4 hari untuk merangsang pertumbuhan miselium. Empat palam agar berdiameter 5 mm kemudian diambil dari tepi hadapan dan diinokulasi dengan 100 g campuran steril gandum dan dedak padi (1:1, v/v) dan semua kelalang diinkubasi pada suhu 25 ± 2 °C di bawah kitaran cahaya 12 jam/gelap 12 jam selama 5 hari untuk merangsang pembentukan sklerotia. Kandungan semua kelalang dicampurkan dengan teliti untuk memastikan kehomogenan sebelum menambah tanah. Kemudian, 100 g campuran dedak yang menjajah telah ditambah ke dalam setiap pasu untuk memastikan kepekatan patogen yang berterusan. Pasu yang telah diinokulasi telah disiram untuk mengaktifkan pertumbuhan kulat dan diletakkan dalam keadaan rumah hijau selama 7 hari.
Lima biji benih varieti Giza 3 kemudiannya disemai dalam setiap pasu. Bagi pasu yang dirawat dengan L-ornitin dan racun kulat Rizolex-T, biji benih yang telah disterilkan terlebih dahulu direndam selama dua jam dalam larutan akueus kedua-dua sebatian tersebut dengan kepekatan IC99 akhir masing-masing kira-kira 250 mg/L dan 50 mg/L, dan kemudian dikeringkan di udara selama satu jam sebelum menyemai. Sebaliknya, biji benih direndam dalam air suling steril sebagai kawalan negatif. Selepas 10 hari, sebelum penyiraman pertama, anak benih dijinakkan, hanya meninggalkan dua anak benih yang kemas dalam setiap pasu. Selain itu, untuk memastikan jangkitan dengan S. sclerotiorum, batang tumbuhan kacang pada peringkat perkembangan yang sama (10 hari) dipotong di dua lokasi berbeza menggunakan pisau bedah yang disterilkan dan kira-kira 0.5 g campuran dedak yang menjajah diletakkan ke dalam setiap luka, diikuti dengan kelembapan yang tinggi untuk merangsang jangkitan dan perkembangan penyakit pada semua tumbuhan yang diinokulasi. Tumbuhan kawalan telah dilucutkan dengan cara yang sama dan jumlah yang sama (0.5 g) campuran dedak steril yang tidak dijajah telah diletakkan ke dalam luka dan dikekalkan di bawah kelembapan yang tinggi untuk mensimulasikan persekitaran untuk perkembangan penyakit dan memastikan konsistensi antara kumpulan rawatan.
Kaedah rawatan: Anak benih kacang disiram dengan 500 ml larutan akueus L-ornitin (250 mg/l) atau racun kulat Rizolex-T (50 mg/l) dengan mengairi tanah, kemudian rawatan diulang tiga kali dengan selang masa 10 hari. Kawalan yang dirawat plasebo disiram dengan 500 ml air suling steril. Semua rawatan dijalankan di bawah keadaan rumah hijau (25 ± 2°C, kelembapan relatif 75 ± 1%, dan fotokala 8 jam terang/16 jam gelap). Semua pasu disiram setiap dua minggu dan dirawat setiap bulan dengan baja NPK seimbang (20-20-20, dengan 3.6% sulfur dan mikrounsur TE; Zain Seeds, Mesir) pada kepekatan 3–4 g/l melalui penyemburan foliar mengikut cadangan untuk varieti tertentu dan arahan pengilang. Melainkan dinyatakan sebaliknya, daun matang yang berkembang sepenuhnya (daun ke-2 dan ke-3 dari atas) dikumpulkan daripada setiap replika biologi pada 72 jam selepas rawatan (hpt), dihomogenkan, dikumpulkan dan disimpan pada suhu -80 °C untuk analisis selanjutnya termasuk, tetapi tidak terhad kepada, penyetempatan histokimia in situ bagi penunjuk tekanan oksidatif, peroksidaan lipid, antioksidan enzimatik dan bukan enzimatik serta ekspresi gen.
Keamatan jangkitan kulat putih dinilai setiap minggu 21 hari selepas inokulasi (dpi) menggunakan skala 1–9 (Jadual Tambahan S2) berdasarkan skala Petzoldt dan Dickson (1996) yang diubah suai oleh Teran et al. (2006). Secara ringkas, batang dan dahan tumbuhan kacang diperiksa bermula pada titik inokulasi untuk mengikuti perkembangan lesi di sepanjang ruas dan nod. Jarak lesi dari titik inokulasi ke titik terjauh di sepanjang batang atau dahan kemudian diukur dan skor 1–9 diberikan berdasarkan lokasi lesi, di mana (1) menunjukkan tiada jangkitan yang kelihatan berhampiran titik inokulasi dan (2–9) menunjukkan peningkatan saiz lesi dan perkembangan secara beransur-ansur di sepanjang nod/ruas (Jadual Tambahan S2). Keamatan jangkitan kulat putih kemudiannya ditukar kepada peratusan menggunakan formula 2:
Di samping itu, luas di bawah lengkung perkembangan penyakit (AUDPC) dikira menggunakan formula (Shaner dan Finney, 1977), yang baru-baru ini diadaptasi untuk reput putih kacang biasa (Chauhan et al., 2020) menggunakan persamaan 3:
Di mana Yi = keterukan penyakit pada masa ti, Yi+1 = keterukan penyakit pada masa seterusnya ti+1, ti = masa pengukuran pertama (dalam hari), ti+1 = masa pengukuran seterusnya (dalam hari), n = jumlah titik masa atau titik pemerhatian. Parameter pertumbuhan tumbuhan kacang termasuk ketinggian tumbuhan (cm), bilangan dahan setiap tumbuhan, dan bilangan daun setiap tumbuhan telah direkodkan setiap minggu selama 21 hari dalam semua replika biologi.
Dalam setiap replika biologi, sampel daun (daun kedua dan ketiga yang berkembang sepenuhnya dari atas) dikumpulkan pada hari ke-45 selepas rawatan (15 hari selepas rawatan terakhir). Setiap replika biologi terdiri daripada lima pasu (dua tumbuhan setiap pasu). Kira-kira 500 mg tisu yang dihancurkan digunakan untuk pengekstrakan pigmen fotosintetik (klorofil a, klorofil b dan karotenoid) menggunakan 80% aseton pada suhu 4 °C dalam keadaan gelap. Selepas 24 jam, sampel disentrifugasi dan supernatan dikumpulkan untuk penentuan kandungan klorofil a, klorofil b dan karotenoid secara kolorimetri menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepun) mengikut kaedah (Lichtenthaler, 1987) dengan mengukur penyerapan pada tiga panjang gelombang yang berbeza (A470, A646 dan A663 nm). Akhir sekali, kandungan pigmen fotosintetik dikira menggunakan formula 4–6 berikut yang diterangkan oleh Lichtenthaler (1987).
Pada 72 jam selepas rawatan (hpt), daun (daun kedua dan ketiga yang berkembang sepenuhnya dari atas) dikumpulkan daripada setiap replika biologi untuk penyetempatan histokimia in situ hidrogen peroksida (H2O2) dan anion superoksida (O2•−). Setiap replika biologi terdiri daripada lima pasu (dua tumbuhan setiap pasu). Setiap replika biologi dianalisis secara berganda (dua replika teknikal) untuk memastikan ketepatan, kebolehpercayaan dan kebolehulangan kaedah tersebut. H2O2 dan O2•− ditentukan menggunakan 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) atau nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman), masing-masing, mengikut kaedah yang diterangkan oleh Romero-Puertas et al. (2004) dan Adam et al. (1989) dengan pengubahsuaian kecil. Untuk penyetempatan histokimia H2O2 in situ, risalah telah disusup vakum dengan 0.1% DAB dalam 10 mM penimbal Tris (pH 7.8) dan kemudian diinkubasi pada suhu bilik di bawah cahaya selama 60 minit. Risalah telah dilunturkan dalam 0.15% (v/v) TCA dalam 4:1 (v/v) etanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaherah, Mesir) dan kemudian didedahkan kepada cahaya sehingga ia menjadi gelap. Begitu juga, injap telah disusup vakum dengan 10 mM penimbal kalium fosfat (pH 7.8) yang mengandungi 0.1 w/v % HBT untuk penyetempatan histokimia O2•− in situ. Risalah telah diinkubasi dalam cahaya pada suhu bilik selama 20 minit, kemudian dilunturkan seperti di atas, dan kemudian diterangi sehingga bintik biru/ungu gelap muncul. Keamatan warna coklat (sebagai penunjuk H2O2) atau biru-ungu (sebagai penunjuk O2•−) yang terhasil telah dinilai menggunakan versi Fiji bagi pakej pemprosesan imej ImageJ (http://fiji.sc; diakses pada 7 Mac 2024).
Malondialdehid (MDA; sebagai penanda peroksidaan lipid) ditentukan mengikut kaedah Du dan Bramlage (1992) dengan sedikit pengubahsuaian. Daun daripada setiap replika biologi (daun kedua dan ketiga yang berkembang sepenuhnya dari atas) dikumpulkan 72 jam selepas rawatan (hpt). Setiap replika biologi termasuk lima pasu (dua tumbuhan setiap pasu). Setiap replika biologi dianalisis secara berganda (dua replika teknikal) untuk memastikan ketepatan, kebolehpercayaan dan kebolehulangan kaedah tersebut. Secara ringkas, 0.5 g tisu daun yang dikisar telah digunakan untuk pengekstrakan MDA dengan 20% asid trikloroasetik (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) yang mengandungi 0.01% butil hidroksitoluena (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kandungan MDA dalam supernatan kemudiannya ditentukan secara kolorimetri dengan mengukur penyerapan pada 532 dan 600 nm menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepun) dan kemudian dinyatakan sebagai nmol g−1 FW.
Untuk penilaian antioksidan bukan enzimatik dan enzimatik, daun (daun kedua dan ketiga yang berkembang sepenuhnya dari atas) dikumpulkan daripada setiap replika biologi pada 72 jam selepas rawatan (hpt). Setiap replika biologi terdiri daripada lima pasu (dua tumbuhan setiap pasu). Setiap sampel biologi dianalisis secara berganda (dua sampel teknikal). Dua daun dikisar dengan nitrogen cecair dan digunakan secara langsung untuk penentuan antioksidan enzimatik dan bukan enzimatik, jumlah asid amino, kandungan prolin, ekspresi gen dan kuantifikasi oksalat.
Jumlah fenolik terlarut ditentukan menggunakan reagen Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dengan sedikit pengubahsuaian kaedah yang diterangkan oleh Kahkonen et al. (1999). Secara ringkas, kira-kira 0.1 g tisu daun yang dihomogenkan diekstrak dengan 20 ml metanol 80% dalam keadaan gelap selama 24 jam dan supernatan dikumpulkan selepas sentrifugasi. 0.1 ml ekstrak sampel dicampurkan dengan 0.5 ml reagen Folin-Ciocalteu (10%), digoncang selama 30 saat dan dibiarkan dalam keadaan gelap selama 5 minit. Kemudian 0.5 ml larutan natrium karbonat 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Mesir) ditambah ke dalam setiap tiub, dicampur dengan teliti dan diinkubasi pada suhu bilik dalam keadaan gelap selama 1 jam. Selepas pengeraman, penyerapan campuran tindak balas diukur pada 765 nm menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepun). Kepekatan jumlah fenol larut dalam ekstrak sampel ditentukan menggunakan lengkung penentukuran asid galik (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) dan dinyatakan sebagai miligram setara asid galik setiap gram berat segar (mg GAE g-1 berat segar).
Kandungan flavonoid larut total ditentukan mengikut kaedah Djeridane et al. (2006) dengan sedikit pengubahsuaian. Secara ringkas, 0.3 ml ekstrak metanol di atas dicampurkan dengan 0.3 ml larutan aluminium klorida 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), dikacau dengan kuat dan kemudian diinkubasi pada suhu bilik selama 5 minit, diikuti dengan penambahan 0.3 ml larutan kalium asetat 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaherah, Mesir), dicampurkan dengan teliti dan diinkubasi pada suhu bilik selama 30 minit dalam keadaan gelap. Selepas pengeraman, penyerapan campuran tindak balas diukur pada 430 nm menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepun). Kepekatan flavonoid larut total dalam ekstrak sampel ditentukan menggunakan lengkung penentukuran rutin (TCI America, Portland, OR, USA) dan kemudian dinyatakan sebagai miligram setara rutin setiap gram berat segar (mg RE g-1 berat segar).
Jumlah kandungan asid amino bebas daun kacang ditentukan menggunakan reagen ninhidrin yang diubah suai (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) berdasarkan kaedah yang dicadangkan oleh Yokoyama dan Hiramatsu (2003) dan diubah suai oleh Sun et al. (2006). Secara ringkas, 0.1 g tisu kisar diekstrak dengan penimbal pH 5.4, dan 200 μL supernatan direaksikan dengan 200 μL ninhidrin (2%) dan 200 μL piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), diinkubasi dalam mandian air mendidih selama 30 minit, kemudian disejukkan dan diukur pada 580 nm menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepun). Sebaliknya, prolin ditentukan dengan kaedah Bates (Bates et al., 1973). Prolina diekstrak dengan 3% asid sulfosalisilik (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) dan selepas sentrifugasi, 0.5 ml supernatan dicampurkan dengan 1 ml asid asetik glasial (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) dan reagen ninhidrin, diinkubasi pada suhu 90°C selama 45 minit, disejukkan dan diukur pada 520 nm menggunakan spektrofotometer yang sama seperti di atas. Jumlah asid amino bebas dan prolina dalam ekstrak daun ditentukan masing-masing menggunakan lengkung penentukuran glisina dan prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), dan dinyatakan sebagai mg/g berat segar.
Untuk menentukan aktiviti enzimatik enzim antioksidan, kira-kira 500 mg tisu yang dihomogenkan telah diekstrak dengan 3 ml penimbal Tris 50 mM (pH 7.8) yang mengandungi 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan 7.5% polivinilpirolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), disentrifugasi pada 10,000 × g selama 20 minit di bawah penyejukan (4 °C), dan supernatan (ekstrak enzim mentah) telah dikumpulkan (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (CAT) kemudiannya direaksikan dengan 2 ml penimbal natrium fosfat 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan 100 μl larutan H2O2 269 mM untuk menentukan aktiviti enzimatiknya mengikut kaedah Aebi (1984) dengan sedikit pengubahsuaian (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Aktiviti enzimatik peroksidase yang bergantung kepada guaiacol (POX) ditentukan menggunakan kaedah Harrach et al. (2009). (2008) dengan pengubahsuaian kecil (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) dan aktiviti enzimatik polifenol oksidase (PPO) ditentukan selepas tindak balas dengan 2.2 ml penimbal natrium fosfat 100 mM (pH 6.0), 100 μl guaiacol (bahan kimia TCI, Portland, OR, USA) dan 100 μl 12 mM H2O2. Kaedah ini diubah suai sedikit daripada (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Pengujian dilakukan selepas tindak balas dengan 3 ml larutan katekol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) yang baru disediakan dalam penimbal fosfat 0.1 M (pH 6.0). Aktiviti CAT diukur dengan memantau penguraian H2O2 pada 240 nm (A240), aktiviti POX diukur dengan memantau peningkatan penyerapan pada 436 nm (A436), dan aktiviti PPO diukur dengan merekodkan turun naik penyerapan pada 495 nm (A495) setiap 30 saat selama 3 minit menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu, Jepun).
RT-PCR masa nyata digunakan untuk mengesan tahap transkrip tiga gen berkaitan antioksidan, termasuk katalase peroksisomal (PvCAT1; No. Aksesi GenBank KF033307.1), superoksida dismutase (PvSOD; No. Aksesi GenBank XM_068639556.1), dan glutation reduktase (PvGR; No. Aksesi GenBank KY195009.1), dalam daun kacang (daun kedua dan ketiga yang berkembang sepenuhnya dari atas) 72 jam selepas rawatan terakhir. Secara ringkas, RNA diasingkan menggunakan Kit Pengekstrakan RNA Total Simply P (No. Kat. BSC52S1; BioFlux, Teknologi Biori, China) mengikut protokol pengeluar. Kemudian, cDNA disintesis menggunakan Kit Sintesis cDNA TOP script™ mengikut arahan pengeluar. Urutan primer bagi tiga gen di atas disenaraikan dalam Jadual Tambahan S3. PvActin-3 (nombor aksesi GenBank: XM_068616709.1) telah digunakan sebagai gen pengemasan dan ekspresi gen relatif dikira menggunakan kaedah 2-ΔΔCT (Livak dan Schmittgen, 2001). Kestabilan aktin di bawah tekanan biotik (interaksi yang tidak serasi antara kekacang biasa dan kulat antraknos Colletotrichum lindemuthianum) dan tekanan abiotik (kemarau, kemasinan, suhu rendah) telah ditunjukkan (Borges et al., 2012).
Pada mulanya, kami menjalankan analisis in silico seluruh genom bagi protein oksaloasetat asetilhidrolase (OAH) dalam S. sclerotiorum menggunakan alat BLAST protein-protein (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Secara ringkas, kami menggunakan OAH daripada Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; nombor penyertaan GenBank XP_040799428.1; 342 asid amino) dan Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; nombor penyertaan GenBank XP_056833920.1; 316 asid amino) sebagai jujukan pertanyaan untuk memetakan protein homolog dalam S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp telah dilakukan terhadap data genom S. sclerotiorum yang paling terkini tersedia dalam GenBank di laman web Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Di samping itu, gen OAH yang diramalkan daripada S. sclerotiorum (SsOAH) dan analisis evolusi serta pokok filogenetik AfOAH daripada A. fijiensis CBS 313.89 dan PlOAH daripada P. lagena telah disimpulkan menggunakan kaedah kemungkinan maksimum dalam MEGA11 (Tamura et al., 2021) dan model berasaskan matriks JTT (Jones et al., 1992). Pokok filogenetik telah digabungkan dengan analisis penjajaran berganda jujukan protein bagi semua gen OAH yang diramalkan (SsOAH) daripada S. sclerotiorum dan jujukan pertanyaan menggunakan Alat Penjajaran Berasaskan Kekangan (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos dan Agarwala, 2007). Di samping itu, jujukan asid amino SsOAH yang paling sepadan daripada S. sclerotiorum telah diselaraskan dengan jujukan pertanyaan (AfOAH dan PlOAH) (Larkin et al., 2007) menggunakan ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), dan kawasan terpelihara dalam penjajaran telah divisualisasikan menggunakan alat ESPript (versi 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Tambahan pula, domain perwakilan berfungsi yang diramalkan dan tapak terpelihara S. sclerotiorum SsOAH telah dikelaskan secara interaktif kepada keluarga yang berbeza menggunakan alat InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Akhir sekali, pemodelan struktur tiga dimensi (3D) bagi S. sclerotiorum SsOAH yang diramalkan telah dilakukan menggunakan Enjin Pengecaman Homologi/Analogi Protein (pelayan Phyre2 versi 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) dan disahkan menggunakan pelayan SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Struktur tiga dimensi yang diramalkan (format PDB) telah divisualisasikan secara interaktif menggunakan pakej UCSF-Chimera (versi 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
PCR pendarfluor masa nyata kuantitatif telah digunakan untuk menentukan tahap transkripsi oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH; nombor aksesi GenBank: XM_001590428.1) dalam miselium Sclerotinia sclerotiorum. Secara ringkas, S. sclerotiorum telah diinokulasi ke dalam kelalang yang mengandungi PDB dan diletakkan di dalam inkubator penggoncang (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) pada suhu 25 ± 2 °C selama 24 jam pada 150 rpm dan dalam kegelapan berterusan (24 jam) untuk merangsang pertumbuhan miselium. Selepas itu, sel-sel telah dirawat dengan L-ornitin dan racun kulat Rizolex-T pada kepekatan IC50 akhir (masing-masing kira-kira 40 dan 3.2 mg/L) dan kemudian dikultur selama 24 jam lagi di bawah keadaan yang sama. Selepas pengeraman, kultur disentrifugasi pada 2500 rpm selama 5 minit dan supernatan (miselium kulat) dikumpulkan untuk analisis ekspresi gen. Begitu juga, miselium kulat dikumpulkan pada 0, 24, 48, 72, 96, dan 120 jam selepas jangkitan daripada tumbuhan yang dijangkiti yang telah membentuk acuan putih dan miselium kapas pada permukaan tisu yang dijangkiti. RNA diekstrak daripada miselium kulat dan kemudian cDNA disintesis seperti yang diterangkan di atas. Urutan primer untuk SsOAH disenaraikan dalam Jadual Tambahan S3. SsActin (nombor aksesi GenBank: XM_001589919.1) digunakan sebagai gen pengemasan, dan ekspresi gen relatif dikira menggunakan kaedah 2-ΔΔCT (Livak dan Schmittgen, 2001).
Asid oksalik telah ditentukan dalam sup dekstrosa kentang (PDB) dan sampel tumbuhan yang mengandungi patogen kulat Sclerotinia sclerotiorum mengikut kaedah Xu dan Zhang (2000) dengan sedikit pengubahsuaian. Secara ringkas, isolat S. sclerotiorum telah diinokulasi ke dalam kelalang yang mengandungi PDB dan kemudian dikultur dalam inkubator yang digoncang (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) pada 150 rpm pada 25 ± 2 °C selama 3–5 hari dalam keadaan gelap berterusan (24 jam) untuk merangsang pertumbuhan miselium. Selepas pengeraman, kultur kulat ditapis terlebih dahulu melalui kertas penapis Whatman #1 dan kemudian disentrifugasi pada 2500 rpm selama 5 minit untuk membuang sisa miselium. Supernatan dikumpulkan dan disimpan pada suhu 4°C untuk penentuan kuantitatif oksalat selanjutnya. Untuk penyediaan sampel tumbuhan, kira-kira 0.1 g serpihan tisu tumbuhan telah diekstrak tiga kali dengan air suling (2 ml setiap kali). Sampel kemudiannya disentrifugasi pada 2500 rpm selama 5 minit, supernatan ditapis kering melalui kertas turas Whatman No. 1 dan dikumpulkan untuk analisis selanjutnya.
Untuk analisis kuantitatif asid oksalik, campuran tindak balas disediakan dalam tiub bertutup kaca mengikut susunan berikut: 0.2 ml sampel (atau filtrat kultur PDB atau larutan piawai asid oksalik), 0.11 ml bromofenol biru (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml 1 M asid sulfurik (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaherah, Mesir) dan 0.176 ml 100 mM kalium dikromat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), dan kemudian larutan dicairkan kepada 4.8 ml dengan air suling, dicampur dengan kuat dan segera diletakkan di dalam tab mandi air 60 °C. Selepas 10 minit, tindak balas dihentikan dengan menambah 0.5 ml larutan natrium hidroksida (NaOH; 0.75 M). Penyerapan (A600) campuran tindak balas diukur pada 600 nm menggunakan spektrofotometer UV-160 (Shimadzu Corporation, Jepun). PDB dan air suling digunakan sebagai kawalan untuk kuantifikasi filtrat kultur dan sampel tumbuhan. Kepekatan asid oksalik dalam filtrat kultur, dinyatakan sebagai mikrogram asid oksalik setiap mililiter medium PDB (μg.mL−1), dan dalam ekstrak daun, dinyatakan sebagai mikrogram asid oksalik setiap gram berat segar (μg.g−1 FW), ditentukan menggunakan lengkung penentukuran asid oksalik (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Sepanjang kajian, semua eksperimen telah direka bentuk dalam reka bentuk rawak sepenuhnya (CRD) dengan enam replika biologi setiap rawatan dan lima pasu setiap replika biologi (dua tumbuhan setiap pasu) melainkan dinyatakan sebaliknya. Replika biologi dianalisis secara berganda (dua replika teknikal). Replika teknikal digunakan untuk menyemak kebolehulangan eksperimen yang sama tetapi tidak digunakan dalam analisis statistik untuk mengelakkan replika palsu. Data dianalisis secara statistik menggunakan analisis varians (ANOVA) diikuti dengan ujian perbezaan ketara Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). Bagi eksperimen in vitro, nilai IC50 dan IC99 dikira menggunakan model probit dan selang keyakinan 95% dikira.
Sebanyak empat isolat telah dikumpulkan dari ladang kacang soya yang berbeza di Gabenor El Ghabiya, Mesir. Pada medium PDA, semua isolat menghasilkan miselium putih berkrim yang cepat bertukar menjadi putih kapas (Rajah 1A) dan kemudian berwarna kuning air atau coklat pada peringkat sklerotium. Sklerotia biasanya padat, hitam, sfera atau tidak sekata bentuknya, panjang 5.2 hingga 7.7 mm dan diameter 3.4 hingga 5.3 mm (Rajah 1B). Walaupun empat isolat membentuk corak sklerotia marginal di tepi medium kultur selepas 10–12 hari pengeraman pada suhu 25 ± 2 °C (Rajah 1A), bilangan sklerotia setiap plat adalah berbeza secara signifikan antara mereka (P < 0.001), dengan isolat 3 mempunyai bilangan sklerotia tertinggi (32.33 ± 1.53 sklerotia setiap plat; Rajah 1C). Begitu juga, isolat #3 menghasilkan lebih banyak asid oksalik dalam PDB berbanding isolat lain (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Rajah 1D). Isolat #3 menunjukkan ciri-ciri morfologi dan mikroskopik tipikal kulat fitopatogen Sclerotinia sclerotiorum. Contohnya, pada PDA, koloni isolat #3 tumbuh dengan cepat, berwarna putih berkrim (Rajah 1A), berwarna kuning air terbalik atau kuning salmon muda, dan memerlukan 6-7 hari pada suhu 25 ± 2°C untuk menutup sepenuhnya permukaan plat berdiameter 9 cm. Berdasarkan ciri-ciri morfologi dan mikroskopik di atas, isolat #3 dikenal pasti sebagai Sclerotinia sclerotiorum.
Rajah 1. Ciri-ciri dan patogenisiti isolat S. sclerotiorum daripada tanaman kekacang biasa. (A) Pertumbuhan miselium empat isolat S. sclerotiorum pada medium PDA, (B) sklerotia empat isolat S. sclerotiorum, (C) bilangan sklerotia (setiap plat), (D) rembesan asid oksalik pada medium PDB (μg.mL−1), dan (E) keterukan penyakit (%) empat isolat S. sclerotiorum pada kultivar kekacang komersial yang mudah terdedah Giza 3 di bawah keadaan rumah hijau. Nilai mewakili min ± SD bagi lima replika biologi (n = 5). Huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan yang signifikan secara statistik antara rawatan (p < 0.05). (F–H) Simptom kulat putih tipikal muncul pada batang dan silique di atas tanah, masing-masing, 10 hari selepas inokulasi dengan isolat #3 (dpi). (I) Analisis evolusi kawasan spacer transkripsi dalaman (ITS) isolat S. sclerotiorum #3 telah dilakukan menggunakan kaedah kemungkinan maksimum dan dibandingkan dengan 20 isolat/strain rujukan yang diperoleh daripada pangkalan data Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Nombor di atas garisan pengelompokan menunjukkan liputan kawasan (%), dan nombor di bawah garisan pengelompokan menunjukkan panjang cabang.
Tambahan pula, untuk mengesahkan patogenisiti, empat isolat S. sclerotiorum yang diperoleh telah digunakan untuk menyuntik kultivar kacang komersial Giza 3 yang mudah terdedah di bawah keadaan rumah hijau, yang selaras dengan postulat Koch (Rajah 1E). Walaupun semua isolat kulat yang diperoleh adalah patogen dan boleh menjangkiti kacang hijau (cv. Giza 3), menyebabkan simptom kulat putih yang tipikal pada semua bahagian di atas tanah (Rajah 1F), terutamanya pada batang (Rajah 1G) dan polong (Rajah 1H) pada 10 hari selepas inokulasi (dpi), isolat 3 adalah isolat paling agresif dalam dua eksperimen bebas. Isolat 3 mempunyai tahap keterukan penyakit (%) tertinggi pada tumbuhan kacang (masing-masing 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, dan 76.7 ± 3.1 pada 7, 14, dan 21 hari selepas jangkitan; Rajah 1F).
Pengenalpastian isolat S. sclerotiorum #3 yang paling invasif telah disahkan selanjutnya berdasarkan penjujukan spacer transkripsi dalaman (ITS) (Rajah 1I). Analisis filogenetik antara isolat #3 dan 20 isolat/strain rujukan menunjukkan persamaan yang tinggi (>99%) antara mereka. Perlu diingatkan bahawa isolat S. sclerotiorum #3 (533 bp) mempunyai persamaan yang tinggi dengan isolat S. sclerotiorum Amerika LPM36 yang diasingkan daripada biji kacang pea kering (nombor penyertaan GenBank MK896659.1; 540 bp) dan isolat S. sclerotiorum Cina YKY211 (nombor penyertaan GenBank OR206374.1; 548 bp), yang menyebabkan reput batang ungu (Matthiola incana), yang semuanya dikumpulkan secara berasingan di bahagian atas dendrogram (Rajah 1I). Urutan baharu telah disimpan dalam pangkalan data NCBI dan dinamakan “Sclerotinia sclerotiorum – isolat YN-25” (nombor aksesi GenBank PV202792). Dapat dilihat bahawa isolat 3 adalah isolat yang paling invasif; oleh itu, isolat ini dipilih untuk kajian dalam semua eksperimen berikutnya.
Aktiviti antibakteria diamina L-ornitin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) pada kepekatan yang berbeza (12.5, 25, 50, 75, 100 dan 125 mg/L) terhadap isolat S. sclerotiorum 3 telah dikaji secara in vitro. Perlu diperhatikan bahawa L-ornitin memberikan kesan antibakteria dan secara beransur-ansur menghalang pertumbuhan jejari hifa S. sclerotiorum secara bergantung dos (Rajah 2A, B). Pada kepekatan tertinggi yang diuji (125 mg/L), L-ornitin menunjukkan kadar perencatan pertumbuhan miselium tertinggi (99.62 ± 0.27%; Rajah 2B), yang bersamaan dengan racun kulat komersial Rizolex-T (kadar perencatan 99.45 ± 0.39%; Rajah 2C) pada kepekatan tertinggi yang diuji (10 mg/L), menunjukkan keberkesanan yang serupa.
Rajah 2. Aktiviti antibakteria in vitro L-ornitinia terhadap Sclerotinia sclerotiorum. (A) Perbandingan aktiviti antibakteria kepekatan L-ornitin yang berbeza terhadap S. sclerotiorum dengan racun kulat komersial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Kadar perencatan (%) pertumbuhan miselium S. sclerotiorum selepas rawatan dengan kepekatan L-ornitin yang berbeza (12.5, 25, 50, 75, 100 dan 125 mg/L) atau Rizolex-T (2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L) masing-masing. Nilai mewakili min ± SD bagi lima replika biologi (n = 5). Huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan statistik antara rawatan (p < 0.05). (D, E) Analisis regresi model Probit bagi L-ornitin dan racun kulat komersial Rizolex-T masing-masing. Garis regresi model probit ditunjukkan sebagai garis biru pejal, dan selang keyakinan (95%) ditunjukkan sebagai garis merah putus-putus.
Di samping itu, analisis regresi probit telah dijalankan dan plot yang sepadan ditunjukkan dalam Jadual 1 dan Rajah 2D,E. Secara ringkas, nilai cerun yang boleh diterima (y = 2.92x − 4.67) dan statistik ketara yang berkaitan (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 dan p < 0.0001; Rajah 2D) bagi L-ornitin menunjukkan aktiviti antikulat yang dipertingkatkan terhadap S. sclerotiorum berbanding racun kulat komersial Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 dan p < 0.0001) (Jadual 1).
Jadual 1. Nilai kepekatan perencatan separuh maksimum (IC50) dan IC99 (mg/l) L-ornitin dan racun kulat komersial “Rizolex-T” terhadap S. sclerotiorum.
Secara keseluruhan, L-ornitin (250 mg/L) mengurangkan perkembangan dan keterukan kulat putih pada tumbuhan kacang biasa yang dirawat dengan ketara berbanding tumbuhan yang dijangkiti S. sclerotiorum yang tidak dirawat (kawalan; Rajah 3A). Secara ringkas, walaupun keterukan penyakit tumbuhan kawalan yang dijangkiti yang tidak dirawat secara beransur-ansur meningkat (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, dan 92.33 ± 3.06%), L-ornitin mengurangkan keterukan penyakit (%) dengan ketara sepanjang eksperimen (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, dan 26.36 ± 3.07) masing-masing pada 7, 14, dan 21 hari selepas rawatan (dpt) (Rajah 3A). Begitu juga, apabila tumbuhan kacang yang dijangkiti S. sclerotiorum dirawat dengan 250 mg/L L-ornitin, luas di bawah lengkung perkembangan penyakit (AUDPC) menurun daripada 1274.33 ± 33.13 dalam kawalan yang tidak dirawat kepada 281.03 ± 7.95, yang sedikit lebih rendah daripada kawalan positif 50 mg/L racun kulat Rizolex-T (183.61 ± 7.71; Rajah 3B). Trend yang sama diperhatikan dalam eksperimen kedua.
Rajah 3. Kesan penggunaan L-ornitin secara eksogen terhadap perkembangan reput putih kacang biasa yang disebabkan oleh Sclerotinia sclerotiorum di bawah keadaan rumah hijau. (A) Lengkung perkembangan penyakit kulat putih kacang biasa selepas rawatan dengan 250 mg/L L-ornitin. (B) Kawasan di bawah lengkung perkembangan penyakit (AUDPC) kulat putih kacang biasa selepas rawatan dengan L-ornitin. Nilai mewakili min ± SD bagi lima replika biologi (n = 5). Huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan yang signifikan secara statistik antara rawatan (p < 0.05).
Penggunaan eksogen 250 mg/L L-ornitin secara beransur-ansur meningkatkan ketinggian tumbuhan (Rajah 4A), bilangan dahan setiap tumbuhan (Rajah 4B), dan bilangan daun setiap tumbuhan (Rajah 4C) selepas 42 hari. Walaupun racun kulat komersial Rizolex-T (50 mg/L) mempunyai kesan terbesar terhadap semua parameter pemakanan yang dikaji, penggunaan eksogen 250 mg/L L-ornitin mempunyai kesan kedua terbesar berbanding kawalan yang tidak dirawat (Rajah 4A–C). Sebaliknya, rawatan L-ornitin tidak mempunyai kesan yang ketara terhadap kandungan pigmen fotosintesis klorofil a (Rajah 4D) dan klorofil b (Rajah 4E), tetapi sedikit meningkatkan jumlah kandungan karotenoid (0.56 ± 0.03 mg/g berat setiap tumbuhan) berbanding kawalan negatif (0.44 ± 0.02 mg/g berat setiap tumbuhan) dan kawalan positif (0.46 ± 0.02 mg/g berat setiap tumbuhan; Rajah 4F). Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa L-ornitin tidak bersifat fitotoksik kepada kekacang yang dirawat dan mungkin merangsang pertumbuhannya.
Rajah 4. Kesan aplikasi L-ornitin eksogen terhadap ciri pertumbuhan dan pigmen fotosintesis daun kacang yang dijangkiti Sclerotinia sclerotiorum di bawah keadaan rumah hijau. (A) Tinggi tumbuhan (cm), (B) Bilangan cabang setiap tumbuhan, (C) Bilangan daun setiap tumbuhan, (D) Kandungan klorofil a (mg g-1 fr wt), (E) Kandungan klorofil b (mg g-1 fr wt), (F) Jumlah kandungan karotenoid (mg g-1 fr wt). Nilai adalah min ± SD bagi lima replika biologi (n = 5). Huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan yang signifikan secara statistik antara rawatan (p < 0.05).
Penyetempatan histokimia in situ bagi spesies oksigen reaktif (ROS; dinyatakan sebagai hidrogen peroksida [H2O2]) dan radikal bebas (dinyatakan sebagai anion superoksida [O2•−]) mendedahkan bahawa penggunaan eksogen L-ornitin (250 mg/L) dengan ketara mengurangkan pengumpulan H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Rajah 5A) dan O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Rajah 5B) berbanding pengumpulan kedua-dua tumbuhan yang dijangkiti dan tidak dirawat (masing-masing 173.31 ± 12.06 dan 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) dan tumbuhan yang dirawat dengan 50 mg/L racun kulat komersial Rizolex-T (masing-masing 170.12 ± 9.50 dan 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt) pada 72 jam. Tahap H2O2 dan O2•− yang tinggi terkumpul di bawah hpt (Rajah 5A, B). Begitu juga, ujian malondialdehid (MDA) berasaskan TCA menunjukkan bahawa tumbuhan kacang yang dijangkiti S. sclerotiorum mengumpul tahap MDA yang lebih tinggi (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) dalam daunnya (Rajah 5C). Walau bagaimanapun, penggunaan L-ornitin secara eksogen mengurangkan peroksidaan lipid dengan ketara seperti yang dibuktikan oleh penurunan kandungan MDA dalam tumbuhan yang dirawat (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Rajah 5. Kesan aplikasi L-ornitin eksogen pada penanda utama tekanan oksidatif dan mekanisme pertahanan antioksidan bukan enzimatik dalam daun kacang yang dijangkiti S. sclerotiorum pada 72 jam selepas jangkitan di bawah keadaan rumah hijau. (A) Hidrogen peroksida (H2O2; nmol g−1 FW) pada 72 hpt, (B) anion superoksida (O2•−; nmol g−1 FW) pada 72 hpt, (C) malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW) pada 72 hpt, (D) jumlah fenol larut (mg GAE g−1 FW) pada 72 hpt, (E) jumlah flavonoid larut (mg RE g−1 FW) pada 72 hpt, (F) jumlah asid amino bebas (mg g−1 FW) pada 72 hpt, dan (G) kandungan prolin (mg g−1 FW) pada 72 hpt. Nilai mewakili min ± sisihan piawai (min ± SD) bagi 5 replika biologi (n = 5). Huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan yang signifikan secara statistik antara rawatan (p < 0.05).