Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau mematikan mod keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Nanopartikel insulin (NP) dengan kandungan pemuatan tinggi telah menemui aplikasi yang berbeza dalam bentuk dos yang berbeza. Kerja ini bertujuan untuk menilai kesan proses pengeringan beku dan pengeringan semburan pada struktur nanopartikel kitosan yang dimuatkan insulin, dengan atau tanpa manitol sebagai krioprotektan. Kami juga menilai kualiti nanopartikel ini dengan melarutkannya semula. Sebelum dehidrasi, saiz zarah nanopartikel kitosan/natrium tripolifosfat/insulin berangkai silang dioptimumkan menjadi 318 nm, PDI ialah 0.18, kecekapan enkapsulasi ialah 99.4%, dan pemuatan ialah 25.01%. Selepas pembentukan semula, semua nanopartikel, kecuali yang dihasilkan melalui kaedah pengeringan beku tanpa penggunaan manitol, mengekalkan struktur zarah sfera mereka. Berbanding dengan nanopartikel yang mengandungi manitol yang dinyahhidratkan melalui mana-mana semburan, nanopartikel kering semburan bebas manitol juga menunjukkan purata saiz zarah terkecil (376 nm) dan kandungan pemuatan tertinggi. (25.02%) dengan kadar enkapsulasi yang serupa (98.7%) dan PDI (0.20) melalui teknik pengeringan atau pengeringan beku. Nanopartikel kering melalui pengeringan semburan tanpa manitol juga menghasilkan pembebasan insulin terpantas dan kecekapan penyerapan selular tertinggi. Kerja ini menunjukkan bahawa pengeringan semburan boleh mengeringkan nanopartikel insulin tanpa memerlukan krioprotektan berbanding kaedah pengeringan beku konvensional, mewujudkan kapasiti pemuatan yang lebih besar, keperluan bahan tambahan yang lebih rendah dan kos operasi yang mempunyai kelebihan yang ketara.
Sejak penemuannya pada tahun 19221,2,3, insulin dan persediaan farmaseutikalnya telah menyelamatkan nyawa pesakit diabetes jenis 1 (T1DM) dan diabetes jenis 2 (T1DM). Walau bagaimanapun, disebabkan oleh sifatnya sebagai protein berat molekul yang tinggi, insulin mudah diagregatkan, dipecahkan oleh enzim proteolitik, dan disingkirkan melalui kesan laluan pertama. Orang yang didiagnosis dengan diabetes jenis 1 memerlukan suntikan insulin sepanjang hayat mereka. Ramai pesakit yang pada mulanya didiagnosis dengan diabetes jenis 2 juga memerlukan suntikan insulin jangka panjang. Suntikan insulin harian merupakan sumber kesakitan dan ketidakselesaan harian yang serius bagi individu ini, dengan kesan negatif terhadap kesihatan mental. Akibatnya, bentuk pemberian insulin lain yang menyebabkan kurang ketidakselesaan, seperti pemberian insulin oral, sedang dikaji secara meluas5 kerana ia berpotensi untuk memulihkan kualiti hidup kira-kira 5 bilion orang yang menghidap diabetes di seluruh dunia.
Teknologi nanopartikel telah memberikan kemajuan yang ketara dalam percubaan untuk mengambil insulin oral4,6,7. Teknologi yang berkesan merangkum dan melindungi insulin daripada degradasi untuk penghantaran yang disasarkan ke tapak badan tertentu. Walau bagaimanapun, penggunaan formulasi nanopartikel mempunyai beberapa batasan, terutamanya disebabkan oleh isu kestabilan penggantungan zarah. Sesetengah pengagregatan mungkin berlaku semasa penyimpanan, yang mengurangkan bioavailabiliti nanopartikel yang dimuatkan dengan insulin8. Di samping itu, kestabilan kimia matriks polimer nanopartikel dan insulin juga mesti dipertimbangkan untuk memastikan kestabilan nanopartikel insulin (NP). Pada masa ini, teknologi pengeringan beku adalah standard emas untuk mencipta NP yang stabil sambil mencegah perubahan yang tidak diingini semasa penyimpanan9.
Walau bagaimanapun, pengeringan beku memerlukan penambahan krioprotektan untuk mengelakkan struktur sfera NP daripada terjejas oleh tekanan mekanikal hablur ais. Ini mengurangkan pemuatan nanopartikel insulin dengan ketara selepas liofilisasi, kerana krioprotektan menduduki sebahagian besar nisbah berat. Oleh itu, NP insulin yang dihasilkan sering didapati tidak sesuai untuk pembuatan formulasi serbuk kering, seperti tablet oral dan filem oral, disebabkan oleh keperluan untuk sejumlah besar nanopartikel kering untuk mencapai tempoh terapeutik insulin.
Pengeringan semburan merupakan proses berskala industri yang terkenal dan murah untuk menghasilkan serbuk kering daripada fasa cecair dalam industri farmaseutikal10,11. Kawalan ke atas proses pembentukan zarah membolehkan enkapsulasi beberapa sebatian bioaktif 12, 13 yang betul. Tambahan pula, ia telah menjadi teknik yang berkesan untuk penyediaan protein yang dienkapsulasi untuk pentadbiran oral. Semasa pengeringan semburan, air menyejat dengan sangat cepat, yang membantu mengekalkan suhu teras zarah rendah11,14, membolehkan aplikasinya untuk merangkum komponen sensitif haba. Sebelum pengeringan semburan, bahan salutan hendaklah dihomogenkan sepenuhnya dengan larutan yang mengandungi bahan yang dienkapsulasi11,14. Tidak seperti pengeringan beku, homogenisasi sebelum enkapsulasi dalam pengeringan semburan meningkatkan kecekapan enkapsulasi semasa dehidrasi. Memandangkan proses enkapsulasi pengeringan semburan tidak memerlukan krioprotektan, pengeringan semburan boleh digunakan untuk menghasilkan NP kering dengan kandungan pemuatan yang tinggi.
Kajian ini melaporkan penghasilan NP yang dimuatkan dengan insulin melalui pengikatan silang kitosan dan natrium tripolifosfat menggunakan kaedah gel ion. Penggelan ion ialah kaedah penyediaan yang membolehkan penghasilan nanopartikel melalui interaksi elektrostatik antara dua atau lebih spesies ionik di bawah keadaan tertentu. Kedua-dua teknik pengeringan beku dan pengeringan semburan digunakan untuk mengeringkan nanopartikel berikat silang kitosan/natrium tripolifosfat/insulin yang dioptimumkan. Selepas dehidrasi, morfologinya dianalisis oleh SEM. Keupayaan penggabungan semula mereka dinilai dengan mengukur taburan saiz, cas permukaan, PDI, kecekapan enkapsulasi dan kandungan pemuatan. Kualiti nanopartikel terlarut semula yang dihasilkan oleh kaedah dehidrasi yang berbeza juga dinilai dengan membandingkan perlindungan insulin, tingkah laku pelepasan dan keberkesanan penyerapan selular mereka.
pH larutan campuran dan nisbah kitosan dan insulin adalah dua faktor utama yang mempengaruhi saiz zarah dan kecekapan enkapsulasi (EE) NP akhir, kerana ia secara langsung mempengaruhi proses gelasi ionotropik. pH larutan campuran terbukti sangat berkorelasi dengan saiz zarah dan kecekapan enkapsulasi (Rajah 1a). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1a, apabila pH meningkat daripada 4.0 kepada 6.0, saiz zarah purata (nm) menurun dan EE meningkat dengan ketara, manakala apabila pH meningkat kepada 6.5, saiz zarah purata mula meningkat dan EE kekal tidak berubah. Apabila nisbah kitosan kepada insulin meningkat, saiz zarah purata juga meningkat. Tambahan pula, tiada perubahan dalam EE diperhatikan apabila nanopartikel disediakan pada nisbah jisim kitosan/insulin lebih tinggi daripada 2.5:1 (b/b) (Rajah 1b). Oleh itu, keadaan penyediaan optimum dalam kajian ini (pH 6.0, nisbah jisim kitosan/insulin 2.5:1) telah digunakan untuk Sediakan nanopartikel yang dimuatkan dengan insulin untuk kajian lanjut. Di bawah keadaan penyediaan ini, saiz zarah purata nanopartikel insulin dioptimumkan menjadi 318 nm (Rajah 1c), PDI ialah 0.18, kecekapan pembenaman ialah 99.4%, potensi zeta ialah 9.8 mv, dan pemuatan insulin ialah 25.01% (m/m). Berdasarkan keputusan mikroskopi elektron penghantaran (TEM), nanopartikel yang dioptimumkan adalah secara kasarnya berbentuk sfera dan diskret dengan saiz yang agak seragam (Rajah 1d).
Pengoptimuman parameter nanopartikel insulin: (a) kesan pH pada diameter purata dan kecekapan enkapsulasi (EE) nanopartikel insulin (disediakan pada nisbah jisim 5:1 kitosan dan insulin); (b) kitosan dan Pengaruh nisbah jisim insulin pada diameter purata dan kecekapan enkapsulasi (EE) NP insulin (disediakan pada pH 6); (c) taburan saiz zarah nanopartikel insulin yang dioptimumkan; (d) mikrograf TEM NP insulin yang dioptimumkan.
Telah diketahui umum bahawa kitosan adalah polielektrolit lemah dengan pKa 6.5. Ia bercas positif dalam media berasid kerana kumpulan amino utamanya diprotonasi oleh ion hidrogen15. Oleh itu, ia sering digunakan sebagai pembawa untuk merangkum makromolekul bercas negatif. Dalam kajian ini, kitosan digunakan untuk merangkum insulin dengan titik isoelektrik 5.3. Oleh kerana kitosan digunakan sebagai bahan salutan, dengan peningkatan perkadarannya, ketebalan lapisan luar nanopartikel meningkat dengan sewajarnya, menghasilkan saiz zarah purata yang lebih besar. Di samping itu, tahap kitosan yang lebih tinggi dapat merangkum lebih banyak insulin. Dalam kes kami, EE adalah tertinggi apabila nisbah kitosan dan insulin mencapai 2.5:1, dan tiada perubahan ketara dalam EE apabila nisbah terus meningkat.
Selain nisbah kitosan dan insulin, pH juga memainkan peranan penting dalam penyediaan NP. Gan et al. 17 mengkaji kesan pH terhadap saiz zarah nanopartikel kitosan. Mereka mendapati penurunan saiz zarah yang berterusan sehingga pH mencapai 6.0, dan peningkatan saiz zarah yang ketara diperhatikan pada pH > 6.0, yang selaras dengan pemerhatian kami. Fenomena ini disebabkan oleh fakta bahawa dengan peningkatan pH, molekul insulin memperoleh cas permukaan negatif, justeru, memihak kepada interaksi elektrostatik dengan kompleks kitosan/natrium tripolifosfat (TPP), menghasilkan saiz zarah yang kecil dan EE yang tinggi. Walau bagaimanapun, apabila pH diselaraskan kepada 6.5, kumpulan amino pada kitosan telah dideprotonasikan, mengakibatkan pelipatan kitosan. Oleh itu, pH yang tinggi mengakibatkan kurang pendedahan ion amino kepada TPP dan insulin, mengakibatkan ikatan silang yang lebih rendah, saiz zarah purata akhir yang lebih besar dan EE yang lebih rendah.
Analisis sifat morfologi NP kering beku dan kering semburan boleh membimbing pemilihan teknik dehidrasi dan pembentukan serbuk yang lebih baik. Kaedah yang diutamakan harus memberikan kestabilan ubat, bentuk zarah yang seragam, pemuatan ubat yang tinggi dan keterlarutan yang baik dalam larutan asal. Dalam kajian ini, untuk membandingkan kedua-dua teknik dengan lebih baik, NP insulin dengan atau tanpa manitol 1% telah digunakan semasa dehidrasi. Manitol digunakan sebagai agen pemukal atau krioprotektan dalam pelbagai formulasi serbuk kering untuk pengeringan beku dan pengeringan semburan. Bagi nanopartikel insulin liofilisasi tanpa manitol, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a, struktur serbuk yang sangat berliang dengan permukaan yang besar, tidak sekata dan kasar diperhatikan di bawah mikroskop elektron imbasan (SEM). Beberapa zarah diskret dikesan dalam serbuk selepas dehidrasi (Rajah 2e). Keputusan ini menunjukkan bahawa kebanyakan NP telah terurai semasa pengeringan beku tanpa sebarang krioprotektan. Bagi nanopartikel insulin kering beku dan kering semburan yang mengandungi 1% manitol, nanopartikel sfera dengan permukaan licin diperhatikan (Rajah 1). 2b,d,f,h). Nanopartikel insulin yang dikeringkan sembur tanpa manitol kekal berbentuk sfera tetapi berkedut pada permukaan (Rajah 2c). Permukaan sfera dan berkedut dibincangkan lebih lanjut dalam ujian tingkah laku pelepasan dan pengambilan selular di bawah. Berdasarkan penampilan NP kering yang kelihatan, kedua-dua NP kering sembur tanpa manitol dan NP kering beku dan kering sembur dengan manitol menghasilkan serbuk NP halus (Rajah 2f,g,h). Semakin besar luas permukaan antara permukaan zarah, semakin tinggi keterlarutan dan oleh itu semakin tinggi kadar pelepasan.
Morfologi NP insulin dehidrasi yang berbeza: (a) Imej SEM NP insulin liofilisasi tanpa manitol; (b) Imej SEM NP insulin liofilisasi dengan manitol; (c) NP insulin kering semburan tanpa manitol Imej SEM bagi ; (d) Imej SEM NP insulin yang dikeringkan semburan dengan manitol; (e) imej serbuk NP insulin liofilisasi tanpa manitol; (f) imej NP insulin liofilisasi dengan manitol; (g) Imej serbuk NP insulin kering semburan tanpa manitol; (h) imej serbuk NP insulin kering semburan dengan manitol.
Semasa pengeringan beku, manitol bertindak sebagai krioprotektan, mengekalkan NP dalam bentuk amorfus dan mencegah kerosakan oleh hablur ais19. Sebaliknya, tiada langkah pembekuan semasa pengeringan semburan. Oleh itu, manitol tidak diperlukan dalam kaedah ini. Malah, NP kering semburan tanpa manitol menghasilkan NP yang lebih halus seperti yang diterangkan sebelum ini. Walau bagaimanapun, manitol masih boleh bertindak sebagai pengisi dalam proses pengeringan semburan untuk memberikan NP struktur yang lebih sfera20 (Rajah 2d), yang membantu mendapatkan tingkah laku pelepasan seragam NP yang dienkapsulasi sedemikian. Di samping itu, adalah jelas bahawa beberapa zarah besar boleh dikesan dalam kedua-dua NP insulin kering beku dan kering semburan yang mengandungi manitol (Rajah 2b,d), yang mungkin disebabkan oleh pengumpulan manitol dalam teras zarah bersama-sama dengan insulin yang dienkapsulasi. Kepada. Lapisan kitosan. Perlu diingatkan bahawa dalam kajian ini, untuk memastikan struktur sfera kekal utuh selepas dehidrasi, nisbah manitol dan kitosan dikekalkan pada 5:1, supaya sejumlah besar pengisi juga boleh membesarkan saiz zarah NP kering.
Spektroskopi pantulan total dilemahkan inframerah transformasi Fourier (FTIR-ATR) mencirikan campuran fizikal insulin bebas, kitosan, kitosan, TPP dan insulin. Semua NP dehidrasi dicirikan dengan menggunakan spektroskopi FTIR-ATR. Terutamanya, keamatan jalur 1641, 1543 dan 1412 cm-1 diperhatikan dalam NP yang dienkapsulasi yang dikeringkan beku dengan manitol dan dalam NP yang dikeringkan semburan dengan dan tanpa manitol (Rajah 3). Seperti yang dilaporkan sebelum ini, peningkatan kekuatan ini dikaitkan dengan penghubung silang antara kitosan, TPP dan insulin. Penyiasatan interaksi antara kitosan dan insulin menunjukkan bahawa dalam spektrum FTIR nanopartikel kitosan yang dimuatkan insulin, jalur kitosan bertindih dengan jalur insulin, meningkatkan keamatan karbonil (1641 cm-1) dan tali pinggang amina (1543 cm-1). Kumpulan tripolifosfat TPP dikaitkan dengan kumpulan ammonium dalam kitosan, membentuk jalur pada 1412 cm-1.
Spektrum FTIR-ATR bagi insulin bebas, kitosan, campuran fizikal kitosan/TPP/insulin dan NP yang didehidrasi melalui kaedah yang berbeza.
Tambahan pula, keputusan ini selaras dengan yang ditunjukkan dalam SEM, yang menunjukkan bahawa NP yang dienkapsulasi kekal utuh apabila disembur dan dikeringkan beku dengan manitol, tetapi jika tiada manitol, hanya pengeringan semburan yang menghasilkan zarah yang dienkapsulasi. Sebaliknya, keputusan spektrum FTIR-ATR bagi NP yang dikeringkan beku tanpa manitol adalah sangat serupa dengan campuran fizikal kitosan, TPP dan insulin. Keputusan ini menunjukkan bahawa ikatan silang antara kitosan, TPP dan insulin tidak lagi terdapat dalam NP yang dikeringkan beku tanpa manitol. Struktur NP telah musnah semasa pengeringan beku tanpa krioprotektan, yang boleh dilihat dalam keputusan SEM (Rajah 2a). Berdasarkan morfologi dan keputusan FTIR bagi NP insulin yang dikeringkan, hanya NP yang diliofilisasi, dikeringkan semburan dan bebas manitol digunakan untuk eksperimen pembentukan semula dan NP bebas manitol disebabkan oleh penguraian NP bebas manitol semasa dehidrasi. bincangkan.
Dehidrasi digunakan untuk penyimpanan jangka panjang dan pemprosesan semula menjadi formulasi lain. Keupayaan NP kering untuk dibentuk semula selepas penyimpanan adalah penting untuk kegunaannya dalam formulasi yang berbeza seperti tablet dan filem. Kami mendapati bahawa saiz zarah purata NP insulin kering semburan tanpa manitol hanya meningkat sedikit selepas pembentukan semula. Sebaliknya, saiz zarah nanopartikel insulin kering semburan dan kering beku dengan manitol meningkat dengan ketara (Jadual 1). PDI dan EE tidak berubah dengan ketara (p > 0.05) selepas penggabungan semula semua NP dalam kajian ini (Jadual 1). Keputusan ini menunjukkan bahawa kebanyakan zarah kekal utuh selepas larut semula. Walau bagaimanapun, penambahan manitol mengakibatkan pengurangan beban insulin nanopartikel manitol liofilisasi dan kering semburan yang banyak (Jadual 1). Sebaliknya, kandungan beban insulin NP kering semburan tanpa manitol kekal sama seperti sebelumnya (Jadual 1).
Telah diketahui umum bahawa pemuatan nanopartikel adalah penting apabila digunakan untuk tujuan penghantaran ubat. Bagi NP dengan pemuatan yang rendah, jumlah bahan yang sangat besar diperlukan untuk mencapai ambang terapeutik. Walau bagaimanapun, kelikatan tinggi kepekatan NP yang tinggi menyebabkan kesulitan dan kesukaran dalam pemberian oral dan formulasi suntikan, masing-masing 22. Di samping itu, NP insulin juga boleh digunakan untuk membuat tablet dan biofilm likat 23, 24, yang memerlukan penggunaan sejumlah besar NP pada tahap pemuatan yang rendah, menghasilkan tablet besar dan biofilm tebal yang tidak sesuai untuk aplikasi oral. Oleh itu, NP dehidrasi dengan beban insulin yang tinggi sangat diingini. Keputusan kami menunjukkan bahawa beban insulin yang tinggi bagi NP semburan kering bebas manitol boleh menawarkan banyak kelebihan menarik untuk kaedah penghantaran alternatif ini.
Semua NP yang telah dikeringkan disimpan di dalam peti sejuk selama tiga bulan. Keputusan SEM menunjukkan bahawa morfologi semua NP yang telah dikeringkan tidak berubah dengan ketara semasa penyimpanan tiga bulan (Rajah 4). Selepas pembentukan semula dalam air, semua NP menunjukkan sedikit penurunan dalam EE dan melepaskan kira-kira sejumlah kecil (~5%) insulin semasa tempoh penyimpanan tiga bulan (Jadual 2). Walau bagaimanapun, saiz zarah purata semua nanopartikel meningkat. Saiz zarah NP yang dikeringkan sembur tanpa manitol meningkat kepada 525 nm, manakala NP yang dikeringkan semburan dan dikeringkan beku dengan manitol masing-masing meningkat kepada 872 dan 921 nm (Jadual 2).
Morfologi NP insulin dehidrasi berbeza yang disimpan selama tiga bulan: (a) Imej SEM NP insulin liofilisasi dengan manitol; (b) Imej SEM nanopartikel insulin kering semburan tanpa manitol; (c) tanpa manitol Imej SEM NP insulin kering semburan.
Tambahan pula, mendakan telah dilihat dalam nanopartikel insulin yang telah dibentuk semula yang dikeringkan dengan manitol dan dikeringkan dengan beku (Rajah S2). Ini mungkin disebabkan oleh zarah besar yang tidak terampai dengan betul di dalam air. Semua keputusan di atas menunjukkan bahawa teknik pengeringan semburan boleh melindungi nanopartikel insulin daripada dehidrasi dan muatan nanopartikel insulin yang tinggi boleh diperolehi tanpa sebarang pengisi atau krioprotektan.
Pengekalan insulin telah diuji dalam medium pH = 2.5 dengan pepsin, tripsin, dan α-kimotripsin untuk menunjukkan keupayaan perlindungan NP terhadap pencernaan enzimatik selepas dehidrasi. Pengekalan insulin NP yang telah dikeringkan telah dibandingkan dengan NP yang baru disediakan, dan insulin bebas telah digunakan sebagai kawalan negatif. Dalam kajian ini, insulin bebas menunjukkan penghapusan insulin yang cepat dalam masa 4 jam dalam ketiga-tiga rawatan enzimatik (Rajah 5a–c). Sebaliknya, ujian penghapusan insulin NP yang dikeringkan beku dengan manitol dan NP yang dikeringkan semburan dengan atau tanpa manitol menunjukkan perlindungan NP ini yang jauh lebih tinggi terhadap pencernaan enzimatik, yang serupa dengan NP insulin yang baru disediakan (rajah 1).5a-c). Dengan bantuan nanopartikel dalam pepsin, tripsin, dan α-kimotripsin, lebih daripada 50%, 60%, dan 75% insulin masing-masing dapat dilindungi dalam masa 4 jam (Rajah 5a–c). Keupayaan perlindungan insulin ini mungkin meningkatkan peluang penyerapan insulin yang lebih tinggi ke dalam aliran darah25. Keputusan ini menunjukkan bahawa pengeringan semburan dengan atau tanpa manitol dan pengeringan beku dengan manitol dapat memelihara keupayaan perlindungan insulin NP selepas dehidrasi.
Perlindungan dan sifat pelepasan NP insulin dehidrasi: (a) perlindungan insulin dalam larutan pepsin; (b) perlindungan insulin dalam larutan tripsin; (c) perlindungan insulin oleh larutan α-kimotripsin; (d) Sifat pelepasan NP dehidrasi dalam larutan pH = 2.5; (e) sifat pelepasan NP dehidrasi dalam larutan pH = 6.6; (f) sifat pelepasan NP dehidrasi dalam larutan pH = 7.0.
NP insulin kering yang baru disediakan dan dibentuk semula telah diinkubasi dalam pelbagai penimbal (pH = 2.5, 6.6, 7.0) pada suhu 37 °C, mensimulasikan persekitaran pH perut, duodenum dan usus kecil bahagian atas, untuk mengkaji kesan insulin terhadap rintangan insulin. Tingkah laku pelepasan dalam persekitaran yang berbeza. Serpihan saluran gastrousus. Pada pH = 2.5, NP yang dimuatkan insulin dan NP insulin kering yang terlarut semula menunjukkan pelepasan pecah awal dalam tempoh satu jam pertama, diikuti dengan pelepasan perlahan selama 5 jam berikutnya (Rajah 5d). Pelepasan pantas pada permulaan ini kemungkinan besar adalah hasil daripada penyerapan permukaan molekul protein yang cepat yang tidak diimobilisasi sepenuhnya dalam struktur dalaman zarah. Pada pH = 6.5, NP yang dimuatkan insulin dan NP insulin kering yang dibentuk semula menunjukkan pelepasan yang lancar dan perlahan selama 6 jam, kerana pH larutan ujian adalah serupa dengan larutan yang disediakan oleh NP (Rajah 5e). Pada pH = 7, NP tidak stabil dan hampir terurai sepenuhnya dalam tempoh dua jam pertama (Rajah 5f). Ini kerana deprotonasi kitosan berlaku pada pH yang lebih tinggi, yang menghasilkan rangkaian polimer yang kurang padat dan pelepasan insulin yang dimuatkan.
Tambahan pula, NP insulin yang dikeringkan dengan semburan tanpa manitol menunjukkan profil pelepasan yang lebih cepat daripada NP dehidrasi yang lain (Rajah 5d–f). Seperti yang diterangkan sebelum ini, NP insulin yang dibentuk semula yang dikeringkan tanpa manitol menunjukkan saiz zarah terkecil. Zarah-zarah kecil memberikan luas permukaan yang lebih besar, jadi kebanyakan ubat yang berkaitan akan berada pada atau berhampiran permukaan zarah, mengakibatkan pelepasan ubat yang cepat26.
Sitotoksisiti NP telah dikaji melalui ujian MTT. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah S4, semua NP yang didehidrasi didapati tidak mempunyai kesan yang ketara terhadap daya tahan sel pada kepekatan 50–500 μg/ml, menunjukkan bahawa semua NP yang didehidrasi boleh digunakan dengan selamat untuk mencapai tempoh terapeutik.
Hati merupakan organ utama yang melaluinya insulin melaksanakan fungsi fisiologinya. Sel HepG2 ialah sel hepatoma manusia yang biasa digunakan sebagai model pengambilan hepatosit in vitro. Di sini, sel HepG2 digunakan untuk menilai pengambilan selular NP yang didehidrasi menggunakan kaedah pengeringan beku dan pengeringan semburan. Pengambilan selular melalui pengimbasan laser confocal menggunakan sitometri aliran dan penglihatan selepas beberapa jam pengeraman dengan insulin FITC bebas pada kepekatan 25 μg/mL, NP sarat insulin FITC yang baru disediakan dan NP sarat insulin FITC yang didehidrasi pada kepekatan insulin yang sama. Pemerhatian mikroskopi kuantitatif (CLSM) telah dilakukan. NP liofilisasi tanpa manitol telah dimusnahkan semasa dehidrasi dan tidak dinilai dalam ujian ini. Keamatan pendarfluor intraselular NP sarat insulin yang baru disediakan, NP liofilisasi dengan manitol dan NP kering semburan dengan dan tanpa manitol (Rajah 6a) adalah 4.3, 2.6, 2.4 dan 4.1 kali ganda lebih tinggi daripada yang bebas. masing-masing kumpulan FITC-insulin (Rajah 6b). Keputusan ini menunjukkan bahawa insulin yang dienkapsulasi lebih kuat dalam pengambilan selular daripada insulin bebas, terutamanya disebabkan oleh saiz nanopartikel yang dimuatkan dengan insulin yang lebih kecil yang dihasilkan dalam kajian ini.
Pengambilan sel HepG2 selepas pengeraman 4 jam dengan NP yang baru disediakan dan NP yang telah dikeringkan: (a) Taburan pengambilan insulin FITC oleh sel HepG2.(b) Purata geometri keamatan pendarfluor yang dianalisis melalui sitometri aliran (n = 3), *P < 0.05 berbanding dengan insulin bebas.
Begitu juga, imej CLSM menunjukkan bahawa keamatan pendarfluor FITC bagi NP yang baru disediakan dengan insulin FITC dan NP kering semburan yang dimuatkan dengan insulin FITC (tanpa manitol) adalah jauh lebih kuat daripada sampel lain (Rajah 6a). Tambahan pula, dengan penambahan manitol, kelikatan larutan yang lebih tinggi meningkatkan rintangan terhadap pengambilan selular, mengakibatkan penurunan percambahan insulin. Keputusan ini menunjukkan bahawa NP kering semburan bebas manitol mempamerkan kecekapan pengambilan selular tertinggi kerana saiz zarahnya lebih kecil daripada NP kering beku selepas pembubaran semula.
Kitosan (berat molekul purata 100 KDa, 75–85% terdeasetilasi) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Natrium tripolifosfat (TPP) telah dibeli daripada VWR (Radnor, Pennsylvania, Amerika Syarikat). Insulin manusia rekombinan yang digunakan dalam kajian ini adalah daripada Fisher Scientific (Waltham, MA, Amerika Syarikat). Insulin manusia berlabel Fluorescein isothiocyanate (FITC) dan 4′,6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorida (DAPI) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Barisan sel HepG2 diperoleh daripada ATCC (Manassas, Virginia, Amerika Syarikat). Semua reagen lain adalah gred analitikal atau kromatografi.
Sediakan larutan CS 1 mg/ml dengan melarutkannya dalam air suling berganda (air DD) yang mengandungi 0.1% asid asetik. Sediakan larutan 1 mg/ml TPP dan insulin dengan melarutkannya dalam air DD dan 0.1% asid asetik. Pra-emulsi disediakan dengan homogenizer berkelajuan tinggi polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Proses penyediaan adalah seperti berikut: pertama, 2ml larutan TPP ditambah kepada 4ml larutan insulin, dan campuran dikacau selama 30 minit dan dicampur sepenuhnya. Kemudian, larutan campuran ditambah setitik demi setitik ke dalam larutan CS melalui picagari di bawah pengacauan berkelajuan tinggi (10,000 rpm). Campuran dikekalkan di bawah pengacauan berkelajuan tinggi (15,000 rpm) dalam mandian ais selama 30 minit, dan ia diselaraskan kepada pH tertentu untuk mendapatkan NP insulin berangkai silang. Untuk menghomogenkan lagi dan mengurangkan saiz zarah NP insulin, ia telah disonikasi selama 30 minit tambahan dalam mandian ais menggunakan sonikator jenis prob (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Jerman).
NPS insulin telah diuji untuk diameter purata-Z, indeks polidispersiti (PDI) dan potensi zeta menggunakan pengukuran penyerakan cahaya dinamik (DLS) menggunakan Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) dengan mencairkannya dalam air DD pada suhu 25°C. Morfologi dan taburan saiz dicirikan oleh mikroskop elektron penghantaran Hitachi H7600 (TEM) (Hitachi, Tokyo, Jepun), dan imej kemudiannya dianalisis menggunakan perisian pengimejan Hitachi (Hitachi, Tokyo, Jepun). Untuk menilai kecekapan enkapsulasi (EE) dan kapasiti pemuatan (LC) NP insulin, NP telah dipipet ke dalam tiub ultrapenapisan dengan pemotongan berat molekul 100 kDa dan disentrifugasi pada 500 xg selama 30 minit. Insulin yang tidak dienkapsulasi dalam filtrat telah diukur menggunakan sistem HPLC Siri Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, California, Amerika Syarikat) yang terdiri daripada pam kuaternari, autosampler, lajur pemanas, dan pengesan DAD. Insulin dianalisis dengan lajur C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) dan dikesan pada 214 nm. Fasa bergerak ialah asetonitril dan air, yang mengandungi 0.1% TFA, nisbah kecerunan dari 10/90 hingga 100/0, dan dijalankan selama 10 minit. Fasa bergerak dipam pada kadar aliran 1.0 ml/min. Suhu lajur ditetapkan kepada 20 °C. Kira peratusan EE dan LC menggunakan persamaan.(1) dan Persamaan.(2).
Pelbagai nisbah CS/insulin antara 2.0 hingga 4.0 telah diuji untuk mengoptimumkan NP insulin. Jumlah larutan CS yang berbeza telah ditambah semasa penyediaan, manakala campuran insulin/TPP dikekalkan malar. NP Insulin disediakan dalam julat pH 4.0 hingga 6.5 dengan mengawal pH campuran dengan teliti selepas menambah semua larutan (insulin, TPP dan CS). EE dan saiz zarah nanopartikel insulin dinilai pada nilai pH dan nisbah jisim CS/insulin yang berbeza untuk mengoptimumkan pembentukan NP insulin.
NP insulin yang dioptimumkan diletakkan di atas bekas aluminium dan ditutup dengan tisu yang diketatkan dengan pita. Selepas itu, bekas yang diskrukan diletakkan di dalam pengering beku Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) yang dilengkapi dengan pengering dulang. Suhu dan tekanan vakum ditetapkan pada -10 °C, 0.350 Torr untuk 2 jam pertama, dan 0 °C dan 0.120 Torr untuk baki 22 jam dalam tempoh 24 jam untuk mendapatkan NP insulin kering.
Pengering Semburan Mini Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, Switzerland) telah digunakan untuk menghasilkan insulin berkapsul. Parameter pengeringan yang dipilih ialah: suhu 100 °C, aliran suapan 3 L/min, dan aliran gas 4 L/min.
NP insulin sebelum dan selepas dehidrasi dicirikan menggunakan spektroskopi FTIR-ATR. Nanopartikel yang dikeringkan serta insulin bebas dan kitosan dianalisis menggunakan spektrofotometer Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Amerika Syarikat) yang dilengkapi dengan aksesori persampelan ATR universal (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Amerika Syarikat). Purata isyarat diperoleh daripada 16 imbasan pada resolusi 4 cm2 dalam julat frekuensi 4000-600 cm2.
Morfologi NP insulin kering telah dinilai melalui imej SEM bagi NP insulin kering beku dan kering semburan yang ditangkap oleh Mikroskop Elektron Pengimbasan Pancaran Ion Terfokus Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, Amerika Syarikat). Parameter utama yang digunakan ialah voltan 5 keV dan arus 30 mA.
Semua NP insulin yang telah dikeringkan telah dilarutkan semula dalam air dd. Saiz zarah, PDI, EE dan LC telah diuji sekali lagi menggunakan kaedah yang sama yang dinyatakan sebelum ini untuk menilai kualitinya selepas dehidrasi. Kestabilan NP anhidroinsulin juga diukur dengan menguji sifat-sifat NP selepas penyimpanan yang berpanjangan. Dalam kajian ini, semua NP selepas dehidrasi disimpan di dalam peti sejuk selama tiga bulan. Selepas tiga bulan penyimpanan, NP telah diuji untuk saiz zarah morfologi, PDI, EE dan LC.
Larutkan 5 mL NP yang telah dibentuk semula dalam 45 mL yang mengandungi cecair gastrik simulasi (pH 1.2, mengandungi 1% pepsin), cecair usus (pH 6.8, mengandungi 1% tripsin) atau larutan kimotripsin (100 g/mL, dalam penimbal fosfat, pH 7.8) untuk menilai keberkesanan insulin dalam melindungi NP selepas dehidrasi. Ia diinkubasi pada suhu 37°C dengan kelajuan pengadukan 100 rpm. 500 μL larutan dikumpulkan pada titik masa yang berbeza dan kepekatan insulin ditentukan oleh HPLC.
Tingkah laku pelepasan in vitro NP insulin yang baru disediakan dan dikeringkan telah diuji dengan kaedah beg dialisis (potongan berat molekul 100 kDa, Spectra Por Inc.). NP kering yang baru disediakan dan dibentuk semula telah didialisis dalam cecair pada pH 2.5, pH 6.6, dan pH 7.0 (saline penimbal fosfat 0.1 M, PBS) untuk mensimulasikan persekitaran pH perut, duodenum, dan usus kecil bahagian atas. Semua sampel diinkubasi pada suhu 37 °C dengan penggoncangan berterusan pada 200 rpm. Sedut cecair di luar beg dialisis 5 mL pada masa berikut: 0.5, 1, 2, 3, 4, dan 6 jam, dan segera isi semula isipadu dengan dialisat segar. Pencemaran insulin dalam cecair dianalisis dengan HPLC, dan kadar pelepasan insulin daripada nanopartikel dikira daripada nisbah insulin bebas yang dilepaskan kepada jumlah insulin yang dienkapsulasi dalam nanopartikel (Persamaan 3).
Sel HepG2 barisan sel karsinoma hepatoselular manusia telah ditumbuhkan dalam piring berdiameter 60 mm menggunakan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) yang mengandungi 10% serum lembu janin, 100 IU/mL penisilin, dan 100 μg/mL streptomisin29. Kultur dikekalkan pada suhu 37°C, kelembapan relatif 95%, dan 5% CO2. Untuk ujian penyerapan, sel HepG2 telah disemai pada 1 × 105 sel/ml ke dalam sistem slaid kebuk Nunc Lab-Tek 8-telaga (Thermo Fisher, NY, USA). Untuk ujian sitotoksisiti, ia telah disemai ke dalam plat 96-telaga (Corning, NY, USA) pada ketumpatan 5 × 104 sel/ml.
Ujian MTT digunakan untuk menilai sitotoksisiti NPs30 insulin yang baru disediakan dan dikeringkan. Sel HepG2 telah disemai dalam plat 96-telaga pada ketumpatan 5 × 104 sel/mL dan dikultur selama 7 hari sebelum ujian. NPs insulin telah dicairkan kepada pelbagai kepekatan (50 hingga 500 μg/mL) dalam medium kultur dan kemudian diberikan kepada sel. Selepas 24 jam pengeraman, sel dibasuh 3 kali dengan PBS dan diinkubasi dengan medium yang mengandungi 0.5 mg/ml MTT selama 4 jam tambahan. Sitotoksisiti dinilai dengan mengukur pengurangan enzimatik MTT tetrazolium kuning kepada formazan ungu pada 570 nm menggunakan pembaca plat spektrofotometer pro Tecan infinite M200 (Tecan, Männedorf, Switzerland).
Kecekapan penyerapan selular NP telah diuji melalui mikroskopi pengimbasan laser confocal dan analisis sitometri aliran. Setiap perigi sistem slaid kebuk Nunc Lab-Tek telah dirawat dengan NP FITC-insulin bebas, FITC-insulin-loaded, dan membentuk semula 25 μg/mL NP FITC-insulin dehidrasi pada kepekatan yang sama dan diinkubasi selama 4 jam. Sel dibasuh 3 kali dengan PBS dan difiksasi dengan 4% paraformaldehid. Nukleus diwarnakan dengan 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Penyetempatan insulin diperhatikan menggunakan mikroskop confocal pengimbasan laser/dua-foton Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Jepun). Untuk analisis sitometri aliran, kepekatan yang sama bagi 10 μg/mL NP FITC-insulin bebas, FITC-insulin-loaded, dan NP FITC-insulin dehidrasi yang terlarut semula telah ditambah ke plat 96-perigi yang disemai dengan sel HepG2 dan diinkubasi selama 4 jam. Selepas 4 jam pengeraman, sel telah dibuang dan dibasuh sebanyak 3 kali dengan FBS. 5 × 104 sel setiap sampel telah dianalisis dengan sitometer aliran BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Amerika Syarikat).
Semua nilai dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai. Perbandingan antara semua kumpulan dinilai menggunakan ANOVA sehala atau ujian-t oleh IBM SPSS Statistics 26 untuk Mac (IBM, Endicott, New York, Amerika Syarikat) dan p <0.05 dianggap signifikan secara statistik.
Kajian ini menunjukkan fleksibiliti dan keupayaan pengeringan semburan untuk mengeringkan nanopartikel kitosan/TPP/insulin bertaut silang dengan pembentukan semula yang lebih baik berbanding kaedah pengeringan beku standard menggunakan kapasiti agen pukal atau krioprotektan dan kapasiti beban yang lebih tinggi. Nanopartikel insulin yang dioptimumkan menghasilkan saiz zarah purata 318 nm dan kecekapan enkapsulasi sebanyak 99.4%. Keputusan SEM dan FTIR selepas dehidrasi menunjukkan bahawa struktur sfera hanya dikekalkan dalam NP kering semburan dengan dan tanpa manitol dan diliofilisasi dengan manitol, tetapi NP yang diliofilisasi tanpa manitol telah terurai semasa dehidrasi. Dalam ujian keupayaan pembentukan semula, nanopartikel insulin yang dikeringkan semburan tanpa manitol menunjukkan saiz zarah purata terkecil dan beban tertinggi semasa pembentukan semula. Tingkah laku pelepasan semua NP dehidrasi ini menunjukkan bahawa ia dibebaskan dengan cepat dalam larutan pH = 2.5 dan pH = 7, dan sangat stabil dalam larutan pH = 6.5. Berbanding dengan NP dehidrasi terlarut semula yang lain, NP Pengeringan semburan tanpa manitol menunjukkan pembebasan terpantas. Keputusan ini selaras dengan yang diperhatikan dalam ujian penyerapan selular, kerana NP yang dikeringkan semburan tanpa manitol hampir mengekalkan kecekapan penyerapan selular NP yang baru disediakan. Keputusan ini menunjukkan bahawa nanopartikel insulin kering yang disediakan melalui pengeringan semburan bebas manitol paling sesuai untuk diproses selanjutnya ke dalam bentuk dos anhidrus lain, seperti tablet oral atau filem biopelekat.
Disebabkan oleh isu harta intelek, set data yang dihasilkan dan/atau dianalisis semasa kajian semasa tidak tersedia untuk umum, tetapi boleh didapati daripada penulis masing-masing atas permintaan yang munasabah.
Kagan, A. Diabetes jenis 2: asal usul sosial dan saintifik, komplikasi perubatan, dan implikasi untuk pesakit dan orang lain. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Perkembangan enkapsulasi insulin: adakah pemberian oral kini mungkin? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Kemajuan terkini dalam sistem penghantaran liposom oral yang dimuatkan dengan insulin untuk rawatan diabetes. Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).