Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk hasil terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan versi pelayar anda yang lebih baharu (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, bagi memastikan sokongan berterusan, kami memaparkan laman web ini tanpa penggayaan atau JavaScript.
Asid propionik (PPA) digunakan untuk mengkaji peranan disfungsi mitokondria dalam gangguan perkembangan saraf seperti gangguan spektrum autisme. PPA diketahui mengganggu biogenesis, metabolisme, dan perolehan mitokondria. Walau bagaimanapun, kesan PPA terhadap dinamik mitokondria, pembelahan dan gabungan kekal bermasalah disebabkan oleh sifat temporal mekanisme ini yang kompleks. Di sini, kami menggunakan teknik pengimejan kuantitatif pelengkap untuk menyiasat bagaimana PPA mempengaruhi ultrastruktur, morfologi, dan dinamik mitokondria dalam sel SH-SY5Y seperti neuron. PPA (5 mM) menyebabkan penurunan ketara dalam kawasan mitokondria (p < 0.01), diameter dan lilitan Feret (p < 0.05), dan kawasan 2 (p < 0.01). Analisis pencari peristiwa mitokondria menunjukkan peningkatan ketara (p < 0.05) dalam peristiwa pembelahan dan gabungan, sekali gus mengekalkan integriti rangkaian mitokondria di bawah keadaan tekanan. Di samping itu, ekspresi mRNA cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) dan OPA1 (p < 0.05) telah berkurangan dengan ketara. 01). Ini menggambarkan pembentukan semula morfologi, biogenesis dan dinamik mitokondria untuk mengekalkan fungsi di bawah keadaan tekanan. Data kami memberikan pandangan baharu tentang kesan PPA terhadap dinamik mitokondria dan menonjolkan kegunaan teknik pengimejan untuk mengkaji mekanisme pengawalseliaan kompleks yang terlibat dalam tindak balas tekanan mitokondria.
Mitokondria merupakan peserta penting dalam pelbagai fungsi selular melangkaui peranan tipikal mereka dalam penghasilan tenaga dan biosintesis. Metabolisme mitokondria merupakan pengawal selia utama bagi isyarat kalsium, homeostasis metabolik dan redoks, isyarat keradangan, pengubahsuaian epigenetik, percambahan sel, pembezaan dan kematian sel terprogram1. Khususnya, metabolisme mitokondria adalah penting untuk perkembangan neuron, kelangsungan hidup dan fungsi dan terlibat secara meluas dalam pelbagai manifestasi neuropatologi2,3,4.
Sepanjang dekad yang lalu, status metabolik telah muncul sebagai pengawal selia pusat neurogenesis, pembezaan, kematangan dan keplastikan5,6. Baru-baru ini, morfologi dan dinamik mitokondria telah menjadi komponen mitosis yang sangat penting, iaitu proses dinamik yang mengekalkan himpunan mitokondria yang sihat dalam sel. Dinamik mitokondria dikawal oleh laluan saling bergantung yang kompleks, bermula daripada biogenesis mitokondria dan bioenergetik kepada pembelahan, gabungan, pengangkutan dan pembersihan mitokondria7,8. Gangguan mana-mana mekanisme integratif ini menjejaskan penyelenggaraan rangkaian mitokondria yang sihat dan mempunyai akibat fungsi yang mendalam untuk perkembangan saraf9,10. Malah, disregulasi dinamik mitokondria diperhatikan dalam banyak gangguan psikiatri, neurodegeneratif dan perkembangan saraf, termasuk gangguan spektrum autisme (ASD)11,12.
ASD ialah gangguan perkembangan saraf heterogen dengan seni bina genetik dan epigenetik yang kompleks. Kebolehwarisan ASD tidak dapat dipertikaikan, tetapi etiologi molekul yang mendasari masih kurang difahami. Pengumpulan data daripada model praklinikal, kajian klinikal dan set data molekul multi-omics memberikan bukti disfungsi mitokondria yang semakin meningkat dalam ASD13,14. Sebelum ini, kami telah menjalankan saringan metilasi DNA seluruh genom dalam kohort pesakit ASD dan mengenal pasti gen termetilasi berbeza yang berkumpul di sepanjang laluan metabolik mitokondria15. Kami kemudiannya melaporkan metilasi pembezaan pengawal selia pusat biogenesis dan dinamik mitokondria, yang dikaitkan dengan peningkatan bilangan salinan mtDNA dan perubahan profil metabolik urin dalam ASD16. Data kami memberikan bukti yang semakin meningkat bahawa dinamik mitokondria dan homeostasis memainkan peranan penting dalam patofisiologi ASD. Oleh itu, meningkatkan pemahaman mekanistik tentang hubungan antara dinamik, morfologi dan fungsi mitokondria merupakan matlamat utama penyelidikan berterusan terhadap penyakit neurologi yang dicirikan oleh disfungsi mitokondria sekunder.
Teknik molekul sering digunakan untuk mengkaji peranan gen tertentu dalam tindak balas tekanan mitokondria. Walau bagaimanapun, pendekatan ini mungkin terhad oleh sifat mekanisme kawalan mitosis yang pelbagai rupa dan temporal. Selain itu, ekspresi gen mitokondria yang berbeza merupakan penunjuk tidak langsung perubahan fungsi, terutamanya kerana hanya bilangan gen yang terhad biasanya dianalisis. Oleh itu, kaedah yang lebih langsung untuk mengkaji fungsi mitokondria dan bioenergetik telah dicadangkan17. Morfologi mitokondria berkait rapat dengan dinamik mitokondria. Bentuk, ketersambungan dan struktur mitokondria adalah penting untuk penghasilan tenaga dan kelangsungan hidup mitokondria dan sel5,18. Selain itu, pelbagai komponen mitosis memberi tumpuan kepada perubahan dalam morfologi mitokondria, yang boleh berfungsi sebagai titik akhir disfungsi mitokondria yang berguna dan menyediakan asas untuk kajian mekanistik seterusnya.
Morfologi mitokondria boleh diperhatikan secara langsung menggunakan mikroskop elektron penghantaran (TEM), yang membolehkan kajian terperinci tentang ultrastruktur selular. TEM secara langsung menggambarkan morfologi, bentuk dan struktur krista mitokondria pada resolusi mitokondria individu, dan bukannya hanya bergantung pada transkripsi gen, ekspresi protein atau parameter fungsi mitokondria dalam populasi sel17,19,20. Di samping itu, TEM memudahkan kajian interaksi antara mitokondria dan organel lain, seperti retikulum endoplasma dan autofagosom, yang memainkan peranan penting dalam fungsi mitokondria dan homeostasis21,22. Oleh itu, ini menjadikan TEM titik permulaan yang baik untuk mengkaji disfungsi mitokondria sebelum menumpukan pada laluan atau gen tertentu. Memandangkan fungsi mitokondria menjadi semakin relevan dengan neuropatologi, terdapat keperluan yang jelas untuk dapat mengkaji morfologi dan dinamik mitokondria secara langsung dan kuantitatif dalam model neuron in vitro.
Dalam artikel ini, kami mengkaji dinamik mitokondria dalam model neuron disfungsi mitokondria dalam gangguan spektrum autisme. Kami sebelum ini melaporkan metilasi pembezaan propionil-CoA karboksilase beta (PCCB) dalam ASD15, subunit enzim propionil-CoA karboksilase mitokondria PCC. Disregulasi PCC diketahui menyebabkan pengumpulan toksik derivatif propionil, termasuk asid propionik (PPA)23,24,25. PPA telah terbukti mengganggu metabolisme neuron dan mengubah tingkah laku secara in vivo dan merupakan model haiwan yang mantap untuk mengkaji mekanisme perkembangan saraf yang terlibat dalam ASD26,27,28. Selain itu, PPA telah dilaporkan mengganggu potensi membran mitokondria, biogenesis dan respirasi secara in vitro dan telah digunakan secara meluas untuk memodelkan disfungsi mitokondria dalam neuron29,30. Walau bagaimanapun, kesan disfungsi mitokondria yang disebabkan oleh PPA terhadap morfologi dan dinamik mitokondria masih kurang difahami.
Kajian ini menggunakan teknik pengimejan pelengkap untuk mengukur kesan PPA terhadap morfologi, dinamik dan fungsi mitokondria dalam sel SH-SY5Y. Pertama, kami membangunkan kaedah TEM untuk menggambarkan perubahan dalam morfologi dan ultrastruktur mitokondria17,31,32. Memandangkan sifat dinamik mitokondria33, kami juga menggunakan analisis penyetempat peristiwa mitokondria (MEL) untuk mengukur perubahan dalam keseimbangan antara peristiwa pembelahan dan gabungan, bilangan dan isipadu mitokondria di bawah tekanan PPA. Akhir sekali, kami mengkaji sama ada morfologi dan dinamik mitokondria dikaitkan dengan perubahan dalam ekspresi gen yang terlibat dalam biogenesis, pembelahan dan gabungan. Secara keseluruhan, data kami menggambarkan cabaran untuk menjelaskan kerumitan mekanisme yang mengawal selia dinamik mitokondria. Kami mengetengahkan kegunaan TEM dalam mengkaji morfologi mitokondria sebagai titik akhir mitosis yang boleh diukur dalam sel SH-SY5Y. Di samping itu, kami mengetengahkan bahawa data TEM memberikan maklumat terkaya apabila digabungkan dengan teknik pengimejan yang juga menangkap peristiwa dinamik sebagai tindak balas kepada tekanan metabolik. Pencirian lanjut mekanisme pengawalseliaan molekul yang menyokong mitosis sel neuron boleh memberikan pandangan penting tentang komponen mitokondria sistem saraf dan penyakit neurodegeneratif.
Untuk mendorong tekanan mitokondria, sel SH-SY5Y dirawat dengan PPA menggunakan 3 mM dan 5 mM natrium propionat (NaP). Sebelum TEM, sampel tertakluk kepada penyediaan sampel kriogenik menggunakan pembekuan dan pembekuan tekanan tinggi (Rajah 1a). Kami membangunkan saluran analisis imej mitokondria automatik untuk mengukur lapan parameter morfologi populasi mitokondria merentasi tiga replika biologi. Kami mendapati bahawa rawatan PPA mengubah empat parameter dengan ketara: kawasan 2, kawasan, perimeter dan diameter Feret (Rajah 1b–e). Kawasan 2 menurun dengan ketara dengan kedua-dua rawatan PPA 3 mM dan 5 mM (p = 0.0183 dan p = 0.002, masing-masing) (Rajah 1b), manakala kawasan (p = 0.003), perimeter (p = 0.0106) dan diameter Feret semuanya menurun dengan ketara. Terdapat pengurangan yang ketara (p = 0.0172) dalam kumpulan rawatan 5 mM berbanding kumpulan kawalan (Rajah 1c–e). Pengurangan ketara dalam luas dan lilitan menunjukkan bahawa sel yang dirawat dengan 5 mM PPA mempunyai mitokondria yang lebih kecil dan lebih bulat, dan mitokondria ini kurang memanjang berbanding sel kawalan. Ini juga konsisten dengan penurunan ketara dalam diameter Feret, parameter bebas yang menunjukkan penurunan jarak terbesar antara tepi zarah. Perubahan dalam ultrastruktur krista diperhatikan: krista menjadi kurang ketara di bawah pengaruh tekanan PPA (Rajah 1a, panel B). Walau bagaimanapun, tidak semua imej mencerminkan ultrastruktur krista dengan jelas, jadi analisis kuantitatif perubahan ini tidak dijalankan. Data TEM ini mungkin mencerminkan tiga senario yang mungkin: (1) PPA meningkatkan pembelahan atau menghalang pelakuran, menyebabkan mitokondria sedia ada mengecil dari segi saiz; (2) biogenesis yang dipertingkatkan mencipta mitokondria baharu yang lebih kecil atau (3) mendorong kedua-dua mekanisme secara serentak. Walaupun keadaan ini tidak dapat dibezakan oleh TEM, perubahan morfologi yang ketara menunjukkan perubahan dalam homeostasis dan dinamik mitokondria di bawah tekanan PPA. Kami kemudiannya meneroka parameter tambahan untuk mencirikan lagi dinamik ini dan mekanisme berpotensi yang mendasarinya.
Asid propionik (PPA) mengubah suai morfologi mitokondria. (a) Imej mikroskopi elektron penghantaran perwakilan (TEM) menunjukkan bahawa saiz mitokondria berkurangan dan mitokondria menjadi lebih kecil dan lebih bulat dengan peningkatan rawatan PPA; 0 mM (tidak dirawat), 3 mM dan 5 mM, masing-masing. Anak panah merah menunjukkan mitokondria. (b–e) Sel SH-SY5Y yang dirawat dengan PPA selama 24 jam disediakan untuk TEM dan hasilnya dianalisis menggunakan Fiji/ImageJ. Empat daripada lapan parameter menunjukkan perbezaan yang ketara antara sel kawalan (tidak dirawat, 0 mM PPA) dan sel yang dirawat (3 mM dan 5 mM PPA). (b) Wilayah 2, (c) Kawasan, (d) Perimeter, (e) Diameter feret. Analisis varians sehala (kawalan vs. rawatan) dan ujian perbandingan berganda Dunnett digunakan untuk menentukan perbezaan yang ketara (p < 0.05). Titik data mewakili nilai mitokondria purata untuk setiap sel individu, dan bar ralat mewakili min ± SEM. Data yang ditunjukkan mewakili n = 3, sekurang-kurangnya 24 sel setiap replikasi; Sebanyak 266 imej telah dianalisis; * menunjukkan p < 0.05, ** menunjukkan p < 0.01.
Untuk mencirikan dengan lebih lanjut bagaimana dinamik mitokondria bertindak balas terhadap PPA, kami mewarnakan mitokondria dengan tetrametilrhodamine etil ester (TMRE) dan menggunakan mikroskopi selang masa dan analisis MEL untuk menyetempatkan dan mengukur mitokondria selepas 24 jam pada 3 dan 5 mM PPA. Rawatan peristiwa pembelahan dan gabungan. (Rajah 2a). Selepas analisis MEL, mitokondria dianalisis selanjutnya untuk mengukur bilangan struktur mitokondria dan isipadu puratanya. Kami memerhatikan peningkatan kecil tetapi ketara dalam bilangan peristiwa pembelahan yang berlaku pada 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] berbanding pembelahan [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] dan peristiwa gabungan [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] dan gabungan [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] meningkat dengan ketara pada 5 mM berbanding kawalan (Rajah 3b). Bilangan mitokondria meningkat dengan ketara pada kedua-dua 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] dan 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Rajah 3c), manakala purata isipadu setiap struktur mitokondria kekal tidak berubah (Rajah 3c). 3d). Secara keseluruhannya, ini menunjukkan bahawa pembentukan semula dinamik mitokondria berfungsi sebagai tindak balas pampasan yang berjaya mengekalkan integriti rangkaian mitokondria. Peningkatan bilangan peristiwa pembelahan pada 3 mM PPA menunjukkan bahawa peningkatan bilangan mitokondria sebahagiannya disebabkan oleh pembelahan mitokondria, tetapi memandangkan purata isipadu mitokondria pada asasnya kekal tidak berubah, biogenesis tidak boleh diketepikan sebagai tindak balas pampasan tambahan. Walau bagaimanapun, data ini selaras dengan struktur mitokondria bulat yang lebih kecil yang diperhatikan oleh TEM dan juga menunjukkan perubahan ketara dalam dinamik mitokondria yang disebabkan oleh PPA.
Asid propionik (PPA) mendorong pembentukan semula mitokondria dinamik untuk mengekalkan integriti rangkaian. Sel SH-SY5Y dikultur, dirawat dengan 3 dan 5 mM PPA selama 24 jam dan diwarnakan dengan TMRE dan Hoechst 33342 diikuti dengan analisis MEL. (a) Imej mikroskopi selang masa perwakilan yang menggambarkan unjuran keamatan maksimum warna dan binari pada masa 2 (t2) untuk setiap keadaan. Kawasan terpilih yang ditunjukkan dalam setiap imej binari dipertingkatkan dan dipaparkan dalam 3D pada tiga jangka masa berbeza (t1-t3) untuk menggambarkan dinamik dari semasa ke semasa; peristiwa gabungan diserlahkan dalam warna hijau; peristiwa pembelahan diserlahkan dalam warna hijau. Dipaparkan dalam warna merah. (b) Purata bilangan peristiwa dinamik setiap keadaan. (c) Purata bilangan struktur mitokondria setiap sel. (d) Purata isipadu (µm3) setiap struktur mitokondria setiap sel. Data yang ditunjukkan mewakili n = 15 sel setiap kumpulan rawatan. Bar ralat yang ditunjukkan mewakili min ± SEM, bar skala = 10 μm, * p < 0.05.
Asid propionik (PPA) menyebabkan penindasan transkripsi gen yang berkaitan dengan dinamik mitokondria. Sel SH-SY5Y dirawat dengan 3 dan 5 mM PPA selama 24 jam. Pengkuantitian gen relatif dilakukan menggunakan RT-qPCR dan dinormalisasikan kepada B2M. Gen biogenesis mitokondria (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 dan (d) NFE2L2. Gen gabungan dan pembelahan mitokondria (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 dan (i) DRP1. Perbezaan ketara (p < 0.05) telah diuji menggunakan ANOVA sehala (kawalan vs. rawatan) dan ujian perbandingan berganda Dunnett: * menunjukkan p < 0.05, ** menunjukkan p < 0.01, dan **** menunjukkan p < 0.0001. Bar mewakili ungkapan min ± SEM. Data yang ditunjukkan mewakili n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), dan n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) replika biologi.
Data daripada analisis TEM dan MEL bersama-sama menunjukkan bahawa PPA mengubah morfologi dan dinamik mitokondria. Walau bagaimanapun, teknik pengimejan ini tidak memberikan gambaran tentang mekanisme asas yang memacu proses ini. Oleh itu, kami mengkaji ekspresi mRNA bagi sembilan pengawal selia utama dinamik mitokondria, biogenesis dan mitosis sebagai tindak balas kepada rawatan PPA. Kami mengukur onkogen myeloma sel (cMYC), faktor pernafasan nuklear (NRF1), faktor transkripsi mitokondria 1 (TFAM), faktor transkripsi seperti NFE2 BZIP (NFE2L2), protein seperti gastrin 2 (STOML2), atrofi saraf optik 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) dan protein berkaitan dinamin 1 (DRP1) selepas 24 jam rawatan dengan 3 mM dan 5 mM PPA. Kami memerhatikan rawatan PPA sebanyak 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 dan p < 0.0001) dan 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001). (Rajah 3a–c). Penurunan ekspresi mRNA bergantung kepada dos: ekspresi cMYC, NRF1 dan TFAM menurun sebanyak 5.7, 2.6 dan 1.9 kali pada 3 mM, dan sebanyak 11.2, 3 dan 2.2 kali pada 5 mM. Sebaliknya, gen biogenesis redoks pusat NFE2L2 tidak diubah pada sebarang kepekatan PPA, walaupun trend ekspresi penurunan yang bergantung kepada dos yang serupa diperhatikan (Rajah 3d).
Kami juga mengkaji ekspresi gen klasik yang terlibat dalam pengawalaturan pembelahan dan pelakuran. STOML2 dianggap terlibat dalam pelakuran, mitofagi dan biogenesis, dan ekspresinya berkurangan dengan ketara (p < 0.0001) sebanyak 3 mM (perubahan 2.4 kali ganda) dan 5 mM (perubahan 2.8 kali ganda) PPA (Rajah 1). 3d). Begitu juga, ekspresi gen pelakuran OPA1 berkurangan pada 3 mM (perubahan 1.6 kali ganda) dan 5 mM (perubahan 1.9 kali ganda) PPA (p = 0.006 dan p = 0.0024, masing-masing) (Rajah 3f). Walau bagaimanapun, kami tidak menemui perbezaan yang ketara dalam ekspresi gen pelakuran MFN1, MFN2 atau gen pembelahan DRP1 di bawah tekanan PPA 24 jam (Rajah 3g–i). Di samping itu, kami mendapati bahawa tahap empat protein gabungan dan pembelahan (OPA1, MFN1, MFN2 dan DRP1) tidak berubah di bawah keadaan yang sama (Rajah 4a–d). Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa data ini mencerminkan satu titik masa dan mungkin tidak mencerminkan perubahan dalam ekspresi protein atau tahap aktiviti semasa peringkat awal tekanan PPA. Walau bagaimanapun, pengurangan ketara dalam ekspresi cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 dan OPA1 menunjukkan disregulasi transkripsi metabolisme, biogenesis dan dinamik mitokondria yang ketara. Di samping itu, data ini menonjolkan kegunaan teknik pengimejan untuk mengkaji secara langsung perubahan keadaan akhir dalam fungsi mitokondria.
Tahap protein pelakuran dan faktor pembelahan tidak berubah selepas rawatan asid propionik (PPA). Sel SH-SY5Y dirawat dengan 3 dan 5 mM PPA selama 24 jam. Tahap protein diukur melalui analisis Western blot, dan tahap ekspresi dinormalisasikan kepada jumlah protein. Purata ekspresi protein dan Western blot yang mewakili protein sasaran dan jumlah protein ditunjukkan. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Bar mewakili min ± SEM, dan data yang ditunjukkan mewakili n = 3 replika biologi. Pelbagai perbandingan (p < 0.05) telah dilakukan menggunakan analisis varians sehala dan ujian Dunnett. Gel dan blot asal ditunjukkan dalam Rajah S1.
Disfungsi mitokondria dikaitkan dengan penyakit multisistem yang terdiri daripada penyakit metabolik, kardiovaskular dan otot hinggalah penyakit neurologi1,10. Banyak penyakit neurodegeneratif dan neurodegeneratif dikaitkan dengan disfungsi mitokondria, yang menonjolkan kepentingan organel ini sepanjang hayat otak. Penyakit ini termasuk penyakit Parkinson, penyakit Alzheimer dan ASD3,4,18. Walau bagaimanapun, akses kepada tisu otak untuk mengkaji penyakit ini adalah sukar, terutamanya pada peringkat mekanistik, menjadikan sistem model selular sebagai alternatif yang diperlukan. Dalam kajian ini, kami menggunakan sistem model selular yang menggunakan sel SH-SY5Y yang dirawat PPA untuk merekapitulasi disfungsi mitokondria yang diperhatikan dalam penyakit neuron, terutamanya gangguan spektrum autisme. Menggunakan model PPA ini untuk mengkaji dinamik mitokondria dalam neuron boleh memberikan gambaran tentang etiologi ASD.
Kami meneroka kemungkinan penggunaan TEM untuk melihat perubahan dalam morfologi mitokondria. Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa TEM mesti digunakan dengan betul untuk memaksimumkan keberkesanannya. Penyediaan spesimen krio membolehkan pemeliharaan struktur neuron yang lebih baik dengan menetapkan komponen selular secara serentak dan mengurangkan pembentukan artifak34. Selaras dengan ini, kami mendapati bahawa sel SH-SY5Y seperti neuron mempunyai organel subselular yang utuh dan mitokondria yang memanjang (Rajah 1a). Ini menonjolkan kegunaan teknik penyediaan kriogenik untuk mengkaji morfologi mitokondria dalam model sel neuron. Walaupun pengukuran kuantitatif adalah penting untuk analisis objektif data TEM, masih tiada konsensus tentang parameter khusus yang harus diukur untuk mengesahkan perubahan morfologi mitokondria. Berdasarkan sebilangan besar kajian yang telah mengkaji morfologi mitokondria secara kuantitatif17,31,32, kami membangunkan saluran analisis imej mitokondria automatik yang mengukur lapan parameter morfologi, iaitu: luas, luas2, nisbah aspek, perimeter, kebulatan, darjah, diameter Feret dan kebulatan.
Antaranya, PPA mengurangkan kawasan 2, kawasan, perimeter dan diameter Feret dengan ketara (Rajah 1b–e). Ini menunjukkan bahawa mitokondria menjadi lebih kecil dan lebih bulat, yang konsisten dengan kajian terdahulu yang menunjukkan penurunan kawasan mitokondria selepas 72 jam tekanan mitokondria yang disebabkan oleh PPA30. Ciri-ciri morfologi ini mungkin menunjukkan pembelahan mitokondria, satu proses yang diperlukan untuk mengasingkan komponen yang rosak daripada rangkaian mitokondria untuk menggalakkan degradasi mereka melalui mitofagi35,36,37. Sebaliknya, penurunan saiz mitokondria purata mungkin dikaitkan dengan peningkatan biogenesis, yang mengakibatkan pembentukan mitokondria kecil yang baru lahir. Peningkatan pembelahan atau biogenesis mewakili tindak balas pampasan untuk mengekalkan mitosis terhadap tekanan mitokondria. Walau bagaimanapun, pertumbuhan mitokondria yang berkurangan, gabungan yang terjejas atau keadaan lain tidak boleh dikecualikan.
Walaupun imej beresolusi tinggi yang dihasilkan oleh TEM membolehkan penentuan ciri-ciri morfologi pada tahap mitokondria individu, kaedah ini menghasilkan snapshot dua dimensi pada satu titik masa. Untuk mengkaji tindak balas dinamik terhadap tekanan metabolik, kami mewarnakan mitokondria dengan TMRE dan menggunakan mikroskopi selang masa dengan analisis MEL, yang membolehkan visualisasi 3D daya pemprosesan tinggi bagi perubahan dalam rangkaian mitokondria dari semasa ke semasa33,38. Kami memerhatikan perubahan yang halus tetapi ketara dalam dinamik mitokondria di bawah tekanan PPA (Rajah 2). Pada 3 mM, bilangan peristiwa pembelahan meningkat dengan ketara, manakala peristiwa gabungan kekal sama seperti dalam kawalan. Peningkatan bilangan peristiwa pembelahan dan gabungan diperhatikan pada 5 mM PPA, tetapi perubahan ini adalah hampir berkadar, menunjukkan bahawa kinetik pembelahan dan gabungan mencapai keseimbangan pada kepekatan yang lebih tinggi (Rajah 2b). Purata isipadu mitokondria kekal tidak berubah pada kedua-dua 3 dan 5 mM PPA, menunjukkan bahawa integriti rangkaian mitokondria dipelihara (Rajah 2d). Ini mencerminkan keupayaan rangkaian mitokondria dinamik untuk bertindak balas terhadap tekanan metabolik ringan untuk mengekalkan homeostasis dengan berkesan tanpa menyebabkan pemecahan rangkaian. Pada 3 mM PPA, peningkatan pembelahan mencukupi untuk menggalakkan peralihan kepada keseimbangan baharu, tetapi pembentukan semula kinetik yang lebih mendalam diperlukan sebagai tindak balas kepada tekanan yang disebabkan oleh kepekatan PPA yang lebih tinggi.
Bilangan mitokondria meningkat pada kedua-dua kepekatan tekanan PPA, tetapi purata isipadu mitokondria tidak berubah dengan ketara (Rajah 2c). Ini mungkin disebabkan oleh peningkatan biogenesis atau peningkatan pembahagian; walau bagaimanapun, jika tiada penurunan ketara dalam purata isipadu mitokondria, biosintesis lebih berkemungkinan meningkat. Walau bagaimanapun, data dalam Rajah 2 menyokong kewujudan dua mekanisme pampasan: peningkatan bilangan peristiwa pembelahan, selaras dengan peningkatan regulasi pembelahan mitokondria, dan peningkatan bilangan peristiwa, selaras dengan biogenesis mitokondria. Akhirnya, pampasan dinamik untuk tekanan ringan mungkin terdiri daripada proses serentak yang melibatkan pembelahan, pelakuran, biogenesis, dan mitofagi. Walaupun penulis terdahulu telah menunjukkan bahawa PPA meningkatkan mitosis30,39 dan mitofagi29, kami menyediakan bukti untuk pembentukan semula pembelahan mitokondria dan dinamik pelakuran sebagai tindak balas kepada PPA. Data ini mengesahkan perubahan morfologi yang diperhatikan oleh TEM dan memberikan pandangan lanjut tentang mekanisme yang berkaitan dengan disfungsi mitokondria yang disebabkan oleh PPA.
Oleh kerana analisis TEM mahupun MEL tidak memberikan bukti langsung tentang mekanisme pengawalaturan gen yang mendasari perubahan morfologi yang diperhatikan, kami mengkaji ekspresi RNA gen yang terlibat dalam metabolisme, biogenesis dan dinamik mitokondria. Proto-onkogen cMYC ialah faktor transkripsi yang terlibat dalam pengawalaturan mitokondria, glikolisis, asid amino dan metabolisme asid lemak40. Di samping itu, cMYC diketahui mengawal selia ekspresi hampir 600 gen mitokondria yang terlibat dalam transkripsi, terjemahan dan pemasangan kompleks mitokondria, termasuk NRF1 dan TFAM41. NRF1 dan TFAM ialah dua pengawal selia pusat mitosis, yang bertindak di hilir PGC-1α untuk mengaktifkan replikasi mtDNA. Laluan ini diaktifkan oleh isyarat cAMP dan AMPK dan sensitif terhadap perbelanjaan tenaga dan tekanan metabolik. Kami juga mengkaji NFE2L2, pengawal selia redoks biogenesis mitokondria, untuk menentukan sama ada kesan PPA mungkin dimediasi oleh tekanan oksidatif.
Walaupun ekspresi NFE2L2 kekal tidak berubah, kami mendapati penurunan yang konsisten bergantung kepada dos dalam ekspresi cMYC, NRF1 dan TFAM selepas 24 jam rawatan dengan 3 mM dan 5 mM PPA (Rajah 3a–c). Penurunan regulasi ekspresi cMYC sebelum ini telah dilaporkan sebagai tindak balas kepada tekanan mitokondria42, dan sebaliknya, penurunan regulasi ekspresi cMYC boleh menyebabkan disfungsi mitokondria dengan mengubah suai metabolisme mitokondria, sambungan rangkaian, dan polarisasi membran43. Menariknya, cMYC juga terlibat dalam pengawalaturan pembelahan dan gabungan mitokondria42,43 dan diketahui meningkatkan fosforilasi DRP1 dan penyetempatan mitokondria semasa pembahagian sel44, serta menjadi perantara pembentukan semula morfologi mitokondria dalam sel stem neuron45. Sesungguhnya, fibroblas kekurangan cMYC mempamerkan saiz mitokondria yang berkurangan, selaras dengan perubahan yang disebabkan oleh tekanan PPA43. Data ini menggambarkan hubungan yang menarik tetapi masih belum jelas antara cMYC dan dinamik mitokondria, memberikan sasaran yang menarik untuk kajian masa depan pembentukan semula yang disebabkan oleh tekanan PPA.
Pengurangan NRF1 dan TFAM adalah selaras dengan peranan cMYC sebagai pengaktif transkripsi yang penting. Data ini juga selaras dengan kajian terdahulu dalam sel kanser kolon manusia yang menunjukkan bahawa PPA mengurangkan ekspresi mRNA NRF1 pada 22 jam, yang dikaitkan dengan pengurangan ATP dan peningkatan ROS46. Penulis ini juga melaporkan bahawa ekspresi TFAM meningkat pada 8.5 jam tetapi kembali ke tahap asas pada 22 jam. Sebaliknya, Kim et al. (2019) menunjukkan bahawa ekspresi mRNA TFAM menurun dengan ketara selepas 4 jam tekanan PPA dalam sel SH-SY5Y; walau bagaimanapun, selepas 72 jam, ekspresi protein TFAM meningkat dengan ketara dan bilangan salinan mtDNA meningkat dengan ketara. Oleh itu, penurunan bilangan gen biogenesis mitokondria yang kami perhatikan selepas 24 jam tidak menolak kemungkinan bahawa peningkatan bilangan mitokondria dikaitkan dengan pengaktifan biogenesis pada titik masa yang lebih awal. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa PPA meningkatkan regulasi mRNA dan protein PGC-1α dengan ketara dalam sel SH-SY5Y pada 4 jam 30 minit, manakala asid propionik meningkatkan biogenesis mitokondria dalam hepatosit anak lembu melalui PGC-1α pada 12 jam 39 minit. Menariknya, PGC-1α bukan sahaja pengawal selia transkripsi langsung NRF1 dan TFAM, tetapi juga telah ditunjukkan untuk mengawal selia aktiviti MFN2 dan DRP1 dengan mengawal selia pembelahan dan gabungan47. Secara keseluruhan, ini menonjolkan gandingan rapat mekanisme yang mengawal selia tindak balas pampasan mitokondria yang disebabkan oleh PPA. Selain itu, data kami mencerminkan disregulasi yang ketara dalam regulasi transkripsi biogenesis dan metabolisme di bawah tekanan PPA.
Gen STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 dan DRP1 adalah antara pengawal selia pusat pembelahan, pelakuran dan dinamik mitokondria37,48,49. Terdapat banyak gen lain yang terlibat dalam dinamik mitokondria, namun, STOML2, OPA1 dan MFN2 sebelum ini didapati termetilasi secara berbeza dalam kohort ASD,16 dan beberapa kajian bebas telah melaporkan perubahan dalam faktor transkripsi ini sebagai tindak balas kepada tekanan mitokondria50,51. 52. Ekspresi kedua-dua OPA1 dan STOML2 berkurangan dengan ketara sebanyak 3 mM dan 5 mM rawatan PPA (Rajah 3e, f). OPA1 adalah salah satu pengawal selia klasik pelakuran mitokondria melalui interaksi langsung dengan MFN1 dan 2 dan memainkan peranan dalam pembentukan semula krista dan morfologi mitokondria53. Peranan tepat STOML2 dalam dinamik mitokondria masih tidak jelas, tetapi bukti menunjukkan bahawa ia memainkan peranan dalam pelakuran mitokondria, biogenesis dan mitofagi.
STOML2 terlibat dalam mengekalkan gandingan pernafasan mitokondria dan pembentukan kompleks rantai pernafasan54,55 dan telah terbukti mengubah ciri-ciri metabolik sel kanser dengan ketara56. Kajian telah menunjukkan bahawa STOML2 menggalakkan potensi membran mitokondria dan biogenesis melalui interaksi dengan BAN dan kardiolipin55, 57, 58. Selain itu, kajian bebas telah menunjukkan bahawa interaksi antara STOML2 dan PINK1 mengawal selia mitofagi59,60. Terutamanya, STOML2 telah dilaporkan berinteraksi secara langsung dengan dan menstabilkan MFN2 dan juga memainkan peranan penting dalam menstabilkan isoform OPA1 yang panjang dengan menghalang protease yang bertanggungjawab untuk degradasi OPA153,61,62. Pengurangan ekspresi STOML2 yang diperhatikan dalam tindak balas PPA boleh menjadikan protein gabungan ini lebih mudah terdedah kepada degradasi melalui laluan yang bergantung kepada ubiquitin dan proteasom48. Walaupun peranan tepat STOML2 dan OPA1 dalam tindak balas dinamik terhadap PPA tidak jelas, penurunan ekspresi gen gabungan ini (Rajah 3) boleh mengganggu keseimbangan antara pembelahan dan gabungan dan menyebabkan penurunan saiz mitokondria (Rajah 3). 1).
Sebaliknya, ekspresi protein OPA1 kekal tidak berubah selepas 24 jam, manakala tahap mRNA dan protein MFN1, MFN2 atau DRP1 tidak berubah dengan ketara selepas rawatan PPA (Rajah 3g-i, Rajah 4). Ini mungkin menunjukkan bahawa tiada perubahan dalam pengawalaturan faktor-faktor ini yang terlibat dalam pelakuran dan pembelahan mitokondria. Walau bagaimanapun, perlu diingatkan bahawa setiap empat gen ini juga dikawal selia oleh pengubahsuaian pascatranskripsi (PTM) yang mengawal aktiviti protein. OPA1 mempunyai lapan varian sambatan alternatif yang dibelah secara proteolitik dalam mitokondria untuk menghasilkan dua isoform yang berbeza 63. Keseimbangan antara isoform panjang dan pendek akhirnya menentukan peranan OPA1 dalam pelakuran mitokondria dan penyelenggaraan rangkaian mitokondria 64. Aktiviti DRP1 dikawal selia oleh fosforilasi protein kinase II (CaMKII) yang bergantung kepada kalsium/kalmodulin, manakala degradasi DRP1 dikawal selia oleh ubiquitination dan SUMOylation 65. Akhir sekali, kedua-dua DRP1 dan MFN1/2 adalah GTPase, jadi aktiviti mungkin dipengaruhi oleh kadar penghasilan GTP dalam mitokondria 66. Oleh itu, walaupun ekspresi protein ini kekal malar, ini mungkin tidak mencerminkan aktiviti protein atau penyetempatan yang tidak berubah 67,68. Sesungguhnya, repertoir protein PTM sedia ada sering berfungsi sebagai barisan pertahanan pertama yang bertanggungjawab untuk menjadi perantara tindak balas tekanan akut. Dengan kehadiran tekanan metabolik sederhana dalam model kami, kemungkinan besar PTM menggalakkan peningkatan aktiviti protein pelakuran dan pembelahan untuk memulihkan integriti mitokondria dengan secukupnya tanpa memerlukan pengaktifan tambahan gen ini pada tahap mRNA atau protein.
Secara keseluruhannya, data di atas mengetengahkan pengawalaturan morfologi mitokondria yang kompleks dan bergantung pada masa serta cabaran untuk menjelaskan mekanisme ini. Untuk mengkaji ekspresi gen, pertama sekali perlu mengenal pasti gen sasaran tertentu dalam laluan tersebut. Walau bagaimanapun, data kami menunjukkan bahawa gen dalam laluan yang sama tidak bertindak balas dengan cara yang sama terhadap tekanan yang sama. Malah, kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa gen yang berbeza dalam laluan yang sama mungkin mempamerkan profil tindak balas temporal yang berbeza30,46. Di samping itu, terdapat mekanisme pasca-transkripsi yang kompleks yang mengganggu hubungan antara transkripsi dan fungsi gen. Kajian proteomik boleh memberikan gambaran tentang kesan PTM dan fungsi protein, tetapi ia juga menimbulkan cabaran termasuk kaedah daya pemprosesan rendah, nisbah isyarat-ke-bunyi yang tinggi, dan resolusi yang lemah.
Dalam konteks ini, mengkaji morfologi mitokondria menggunakan TEM dan MEL mempunyai potensi besar untuk menjawab persoalan asas tentang hubungan antara dinamik dan fungsi mitokondria dan bagaimana ini mempengaruhi penyakit. Paling penting, TEM menyediakan kaedah langsung untuk mengukur morfologi mitokondria sebagai titik akhir konvergen bagi disfungsi dan dinamik mitokondria51. MEL juga menyediakan kaedah langsung untuk menggambarkan peristiwa pembelahan dan gabungan dalam persekitaran selular tiga dimensi, yang membolehkan kuantifikasi pembentukan semula mitokondria dinamik walaupun tanpa perubahan dalam ekspresi gen33. Di sini kami mengetengahkan kegunaan teknik pengimejan mitokondria dalam penyakit mitokondria sekunder. Penyakit ini biasanya dicirikan oleh tekanan metabolik ringan kronik yang dicirikan oleh pembentukan semula rangkaian mitokondria yang halus dan bukannya kerosakan mitokondria akut. Walau bagaimanapun, pampasan mitokondria yang diperlukan untuk mengekalkan mitosis di bawah tekanan kronik mempunyai akibat fungsi yang mendalam. Dalam konteks neurosains, pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme pampasan ini boleh memberikan maklumat penting tentang neuropatologi pleiotropik yang berkaitan dengan disfungsi mitokondria.
Akhirnya, data kami mengetengahkan kegunaan teknik pengimejan untuk memahami akibat fungsi interaksi kompleks antara ekspresi gen, pengubahsuaian protein dan aktiviti protein yang mengawal dinamik mitokondria neuron. Kami menggunakan PPA untuk memodelkan disfungsi mitokondria dalam model sel neuron untuk mendapatkan gambaran tentang komponen mitokondria ASD. Sel SH-SY5Y yang dirawat dengan PPA menunjukkan perubahan dalam morfologi mitokondria: mitokondria menjadi kecil dan bulat, dan krista kurang jelas apabila diperhatikan oleh TEM. Analisis MEL menunjukkan bahawa perubahan ini berlaku serentak dengan peningkatan peristiwa pembelahan dan gabungan untuk mengekalkan rangkaian mitokondria sebagai tindak balas kepada tekanan metabolik yang ringan. Selain itu, PPA mengganggu pengawalaturan transkripsi metabolisme dan homeostasis mitokondria dengan ketara. Kami mengenal pasti cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 dan OPA1 sebagai pengawal selia mitokondria utama yang terganggu oleh tekanan PPA dan mungkin memainkan peranan dalam menjadi pengantara perubahan morfologi dan fungsi mitokondria yang disebabkan oleh PPA. Kajian masa depan diperlukan untuk mencirikan perubahan temporal yang disebabkan oleh PPA dalam ekspresi gen dan aktiviti protein, penyetempatan dan pengubahsuaian pasca-translasi dengan lebih baik. Data kami mengetengahkan kerumitan dan saling kebergantungan mekanisme pengawalseliaan yang menjadi perantara tindak balas tekanan mitokondria dan menunjukkan kegunaan TEM dan teknik pengimejan lain untuk kajian mekanistik yang lebih disasarkan.
Barisan sel SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich. Sel SH-SY5Y telah ditumbuhkan dalam campuran nutrien medium/F-12 Eagle yang diubah suai Dulbecco (DMEM/F-12) dan L-glutamin (SC09411, ScienCell) dalam kelalang 25 cm2 yang ditambah dengan 20% serum lembu janin (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) dan 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) pada suhu 37 °C, 5% CO2. Sel telah disubkultur kepada pertemuan 80% menggunakan 0.05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), disentrifugasi pada 300 g dan disadur pada ketumpatan kira-kira 7 × 105 sel/ml. Semua eksperimen telah dijalankan pada sel SH-SY5Y yang tidak dibezakan antara laluan 19–22. PPA diberikan sebagai NaP. Larutkan serbuk NaP (CAS No. 137-40-6, formula kimia C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) dalam air MilliQ suam hingga kepekatan 1 M dan simpan pada suhu 4 °C. Pada hari rawatan, cairkan larutan ini dengan 1 M PPA kepada 3 mM dan 5 mM PPA dalam medium bebas serum (DMEM/F-12 dengan L-glutamin). Kepekatan rawatan untuk semua eksperimen adalah tiada PPA (0 mM, kawalan), 3 mM, dan 5 mM PPA. Eksperimen telah dijalankan dalam sekurang-kurangnya tiga replika biologi.
Sel SH-SY5Y telah disemai ke dalam kelalang 25 cm5 pada kadar 5.5 × 105 sel/ml dan ditumbuhkan selama 24 jam. Rawatan PPA telah ditambah ke dalam kelalang sebelum 24 jam pengeraman. Kumpulkan pelet sel mengikut protokol subkultur tisu mamalia biasa (diterangkan di atas). Suspensi semula pelet sel dalam 100 µl 2.5% glutaraldehida, 1× PBS dan simpan pada suhu 4 °C sehingga diproses. Sel SH-SY5Y telah disentrifugasi sebentar untuk mengempelkan sel dan membuang 2.5% glutaraldehida, 1× larutan PBS. Suspensi semula sedimen dalam gel agarosa 4% yang disediakan dalam air suling (nisbah agarosa kepada isipadu sedimen ialah 1:1). Kepingan agarosa diletakkan di atas grid pada plat rata dan disalut dengan 1-heksadekena sebelum pembekuan tekanan tinggi. Sampel dibekukan dalam 100% aseton kering pada -90°C selama 24 jam. Suhu kemudiannya dinaikkan kepada -80°C dan larutan 1% osmium tetroksida dan 0.1% glutaraldehida telah ditambah. Sampel disimpan pada suhu -80°C selama 24 jam. Selepas ini, suhu secara beransur-ansur ditingkatkan kepada suhu bilik selama beberapa hari: dari – 80 °C hingga – 50 °C selama 24 jam, kepada – 30 °C selama 24 jam, kepada – 10 °C selama 24 jam dan akhirnya kepada suhu bilik.
Selepas penyediaan kriogenik, sampel telah diresapi dengan resin dan keratan ultranipis (∼100 nm) telah dibuat menggunakan ultramikrotom Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Keratan telah diwarnakan dengan 2% uranil asetat dan plumbum sitrat. Sampel telah diperhatikan menggunakan mikroskop elektron penghantaran FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (dahulunya FEI), Eindhoven, Belanda) yang beroperasi pada 200 kV (pemancar Lab6) dan kamera CCD Gatan (Gatan, UK) yang dilengkapi dengan penapis tenaga Tridiem.
Dalam setiap replikasi teknikal, sekurang-kurangnya 24 imej sel tunggal telah diperoleh, dengan sejumlah 266 imej. Semua imej dianalisis menggunakan makro Kawasan Kepentingan (ROI) dan makro Mitokondria. Makro mitokondria adalah berdasarkan kaedah yang diterbitkan17,31,32 dan membolehkan pemprosesan kelompok separa automatik imej TEM dalam Fiji/ImageJ69. Secara ringkasnya: imej diterbalikkan dan diterbalikkan menggunakan penolakan latar belakang bola bergolek (jejari 60 piksel) dan penapis jalur laluan FFT (masing-masing menggunakan batas atas dan bawah 60 dan 8 piksel) dan penindasan garis menegak dengan toleransi orientasi sebanyak 5%. Imej yang diproses dihadkan secara automatik menggunakan algoritma entropi maksimum dan topeng binari dijana. Kawasan imej yang berkaitan dengan ROI yang dipilih secara manual dalam imej TEM mentah telah diekstrak, mencirikan mitokondria dan mengecualikan membran plasma dan kawasan kontras tinggi yang lain. Bagi setiap ROI yang diekstrak, zarah binari yang lebih besar daripada 600 piksel telah dianalisis, dan luas zarah, perimeter, paksi major dan minor, diameter Feret, kebulatan dan kebutaran telah diukur menggunakan fungsi pengukuran terbina dalam Fiji/ImageJ. Mengikuti Merrill, Flippo dan Strack (2017), luas 2, nisbah aspek zarah (nisbah paksi major kepada minor), dan faktor bentuk (FF) telah dikira daripada data ini, yang mana FF = perimeter 2/4pi x luas. Takrifan formula parametrik boleh didapati dalam Merrill, Flippo dan Strack (2017). Makro yang dinyatakan tersedia di GitHub (lihat Pernyataan Ketersediaan Data). Secara purata, kira-kira 5,600 zarah telah dianalisis setiap rawatan PPA, dengan jumlah kira-kira 17,000 zarah (data tidak ditunjukkan).
Sel SH-SH5Y diletakkan di dalam piring kultur 8 ruang (ThermoFisher, #155411) untuk membolehkan lekatan semalaman dan kemudian diinkubasi dengan TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) dan Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Pencelupan. Imej diperoleh menggunakan laser 405 nm dan 561 nm dalam persekitaran 10 minit, dan imej mentah diperoleh sebagai susunan-z yang mengandungi 10 mikrograf imej dengan langkah az 0.2 μm antara bingkai imej pada 12 titik masa berikutnya. Imej dikumpulkan menggunakan platform resolusi super Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman) menggunakan kanta LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Imej telah dianalisis dalam ImageJ menggunakan saluran paip yang diterangkan sebelum ini dan plugin ImageJ untuk mengukur peristiwa pelakuran dan pembelahan, purata bilangan struktur mitokondria dan purata isipadu mitokondria setiap sel33. Makro MEL boleh didapati di GitHub (lihat Pernyataan Ketersediaan Data).
Sel SH-SY5Y ditumbuhkan dalam plat enam telaga pada ketumpatan 0.3 × 106 sel/mL selama 24 jam sebelum rawatan. RNA diekstrak menggunakan protokol Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) dengan sedikit pengubahsuaian: tambah 300 μl penimbal lisis RNA ke dalam setiap telaga sebelum penyingkiran dan lisiskan setiap sampel sebagai langkah terakhir dengan 30 μl elusi DNase/RNase. -air bebas. Semua sampel diperiksa untuk kuantiti dan kualiti menggunakan Spektrofotometer UV-Vis NanoDrop ND-1000. Jumlah protein daripada lisat sel diperoleh menggunakan 200 μl penimbal lisis RIPA, dan kepekatan protein diukur menggunakan ujian protein Bradford70.
Sintesis cDNA telah dilakukan menggunakan Kit Sintesis cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) mengikut arahan pengilang dengan beberapa pengubahsuaian. cDNA telah disintesis dalam tindak balas 20-μl menggunakan 0.7 hingga 1 μg jumlah RNA. Primer telah dipilih daripada kertas kerja yang diterbitkan sebelum ini 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Jadual S1) dan prob yang disertakan telah direka bentuk menggunakan alat PrimerQuest daripada Integrated DNA Technologies. Semua gen yang diminati telah dinormalisasikan kepada gen B2M nuklear. Ekspresi gen STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC dan OPA1 telah diukur dengan RT-qPCR. Campuran induk termasuk LUNA Taq polimerase (M3003L, New England Biolabs), primer hadapan dan terbalik 10 μM, cDNA dan air gred PCR untuk menghasilkan isipadu akhir 10 μL bagi setiap tindak balas. Ekspresi gen pembahagian dan pembelahan (DRP1, MFN1/2) diukur menggunakan ujian multipleks TaqMan. Campuran Induk qPCR Luna Universal Probe (M3004S, New England Biolabs) telah digunakan mengikut arahan pengilang dengan pengubahsuaian kecil. Campuran induk RT-qPCR multipleks termasuk 1X LUNA Taq polimerase, primer hadapan dan terbalik 10 μM, prob 10 μM, cDNA dan air gred PCR, menghasilkan isipadu akhir 20 μL bagi setiap tindak balas. RT-qPCR dilakukan menggunakan Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nombor siri: R0618110). Keadaan kitaran ditunjukkan dalam Jadual S1. Semua sampel cDNA telah dikuatkan dalam tiga kali ganda dan lengkung piawai telah dijana menggunakan satu siri pencairan sepuluh kali ganda. Pencilan dalam sampel tiga kali ganda dengan sisihan piawai ambang kitaran (Ct) >0.5 telah dialih keluar daripada analisis untuk memastikan kebolehulangan data30,72. Ekspresi gen relatif telah dikira menggunakan kaedah 2-ΔΔCt79.
Sampel protein (60 μg) dicampurkan dengan penimbal pemuatan Laemmli pada nisbah 2:1 dan dijalankan pada gel protein tidak berwarna 12% (Bio-Rad #1610184). Protein dipindahkan ke membran PVDF (polivinilidena fluorida) (#170-84156, Bio-Rad) menggunakan sistem Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Membran disekat dan diinkubasi dengan antibodi primer yang sesuai (OPA1, MFN1, MFN2, dan DRP1) (dicairkan 1:1000) selama 48 jam, diikuti dengan pengeraman dengan antibodi sekunder (1:10,000) selama 1 jam. Membran kemudiannya diimej menggunakan Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) dan direkodkan menggunakan sistem Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab versi 6.1 telah digunakan untuk analisis Western blot. Gel dan blot asal ditunjukkan dalam Rajah S1. Maklumat antibodi disediakan dalam Jadual S2.
Set data dibentangkan sebagai min dan ralat piawai min (SEM) bagi sekurang-kurangnya tiga sampel bebas. Set data diuji untuk normaliti menggunakan ujian Shapiro-Wilks (melainkan dinyatakan sebaliknya) sebelum mengandaikan taburan Gaussian dan sisihan piawai yang sama dan meneruskan analisis. Selain menganalisis set data menggunakan Fisher's MEL LSD (p < 0.05), ANOVA sehala (min rawatan vs. kawalan), dan ujian perbandingan berganda Dunnett untuk menentukan keertian (p < 0.05). Nilai p yang signifikan ditunjukkan dalam graf sebagai *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Semua analisis statistik dan graf telah dijalankan dan dijana menggunakan GraphPad Prism 9.4.0.
Makro Fiji/ImageJ untuk analisis imej TEM tersedia secara umum di GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Pencari Peristiwa Mitokondria (MEL) tersedia secara umum di GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM dan Vijaya A. Mitokondria: pengawal selia utama metabolisme, homeostasis, tekanan, penuaan dan epigenetik. Bahasa Indonesia. Sains Bioperubatan. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfungsi mitokondria pelbagai rupa dalam skizofrenia, kompleks I sebagai sasaran patologi yang mungkin. Skizofrenia. sumber. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. dan Beal, MF Disfungsi mitokondria dalam penyakit Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG dan Mehta V. Mitokondria tertekan: sasaran pencerobohan dalam penyakit Alzheimer. Mitokondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF dan Ferreira GK Mitokondria dan otak: bioenergetik dan banyak lagi. Neurotoksin. sumber. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitokondria pleiotropik: kesan mitokondria terhadap perkembangan neuron dan penyakit. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. dan Morais, VA Biogenesis mitokondria dalam neuron: bagaimana dan di mana. keantarabangsaan. J. Mohr. sains. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. dan Zhao, J. Pengawalaturan dinamik mitokondria mamalia: peluang dan cabaran. hadapan. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. dan Slack, RS Dinamik mitokondria dalam pengawalaturan neurogenesis: daripada perkembangan otak kepada perkembangan otak dewasa. dinamik. 247, 47–53 (2018).