Sekarang *Alamat semasa: Cologne 50931, Jerman, Penyelidikan Kluster Kecemerlangan Cologne mengenai Tindak Balas Tekanan Selular dalam Penyakit Berkaitan Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi penyakit mitokondria dianggap tidak dapat dipulihkan kerana keplastikan metabolik neuron adalah terhad, tetapi kesan disfungsi mitokondria terhadap autonomi sel metabolisme neuron dalam badan kurang difahami. Di sini, kami memperkenalkan proteom khusus sel neuron Purkinje dengan kekurangan OXPHOS progresif yang disebabkan oleh dinamik gabungan mitokondria yang terganggu. Kami mendapati bahawa disfungsi mitokondria mencetuskan perubahan mendalam dalam bidang proteomik, yang akhirnya membawa kepada pengaktifan berjujukan program metabolik yang tepat sebelum kematian sel. Tanpa diduga, kami menentukan induksi piruvat karboksilase (PCx) dan enzim anti-penuaan lain yang jelas yang menambah perantaraan kitaran TCA. Perencatan PCx memburukkan lagi tekanan oksidatif dan neurodegenerasi, menunjukkan bahawa aterosklerosis mempunyai kesan perlindungan pada neuron yang kekurangan OXPHOS. Pemulihan gabungan mitokondria dalam neuron yang mengalami degenerasi terminal membalikkan sepenuhnya ciri-ciri metabolik ini, sekali gus mencegah kematian sel. Penemuan kami mengenal pasti laluan yang sebelum ini tidak diketahui yang memberikan daya tahan kepada disfungsi mitokondria dan menunjukkan bahawa neurodegenerasi boleh dibalikkan walaupun pada peringkat akhir penyakit.
Peranan utama mitokondria dalam mengekalkan metabolisme tenaga neuron ditekankan oleh gejala neurologi yang meluas yang berkaitan dengan penyakit mitokondria manusia. Kebanyakan penyakit ini disebabkan oleh mutasi gen yang mengawal selia ekspresi gen mitokondria (1, 2) atau pemusnahan gen yang berkaitan dengan dinamik mitokondria, yang secara tidak langsung mempengaruhi kestabilan DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Kajian dalam model haiwan telah menunjukkan bahawa sebagai tindak balas kepada disfungsi mitokondria dalam tisu sekeliling, laluan metabolik konservatif (5-7) boleh diaktifkan, yang memberikan maklumat penting untuk pemahaman yang mendalam tentang patogenesis penyakit kompleks ini. Sebaliknya, pemahaman kita tentang perubahan metabolik jenis sel tertentu yang disebabkan oleh kegagalan umum penghasilan adenosina trifosfat (ATP) mitokondria otak adalah asas (8), menekankan keperluan untuk mengenal pasti sasaran terapeutik yang boleh digunakan untuk mencegah atau mencegah penyakit. Mencegah neurodegenerasi (9). Kekurangan maklumat adalah hakikat bahawa sel saraf secara meluas dianggap mempunyai fleksibiliti metabolik yang sangat terhad berbanding dengan jenis sel tisu sekeliling (10). Memandangkan sel-sel ini memainkan peranan penting dalam menyelaraskan bekalan metabolit kepada neuron untuk menggalakkan penghantaran sinaptik dan bertindak balas terhadap keadaan kecederaan dan penyakit, keupayaan untuk menyesuaikan metabolisme sel kepada keadaan tisu otak yang mencabar hampir terhad kepada sel glial (11-14). Di samping itu, heterogeniti selular yang wujud dalam tisu otak sebahagian besarnya menghalang kajian perubahan metabolik yang berlaku dalam subkumpulan neuron tertentu. Akibatnya, sedikit yang diketahui tentang akibat selular dan metabolik yang tepat daripada disfungsi mitokondria dalam neuron.
Untuk memahami akibat metabolik disfungsi mitokondria, kami mengasingkan neuron Purkinje (PN) dalam pelbagai peringkat neurodegenerasi yang disebabkan oleh pemusnahan gabungan membran luar mitokondria (Mfn2). Walaupun mutasi Mfn2 pada manusia dikaitkan dengan sejenis neuropati sensori motor keturunan yang dikenali sebagai Charcot-Marie-Tooth jenis 2A (15), pemusnahan bersyarat Mfn2 pada tikus adalah kaedah disfungsi induksi pengoksidaan (OXPHOS) yang diiktiraf dengan baik. Pelbagai subjenis neuron (16-19) dan fenotip neurodegeneratif yang terhasil disertai dengan gejala neurologi progresif, seperti gangguan pergerakan (18, 19) atau ataksia serebelum (16). Dengan menggunakan gabungan proteomik kuantitatif bebas label (LFQ), metabolomik, pengimejan dan kaedah virologi, kami menunjukkan bahawa neurodegenerasi progresif sangat mendorong piruvat karboksilase (PCx) dan faktor lain yang terlibat dalam arteriosklerosis PN in vivo Ekspresi enzim. Untuk mengesahkan kerelevanan penemuan ini, kami secara khusus menurunkan regulasi ekspresi PCx dalam PN kekurangan Mfn2, dan mendapati bahawa operasi ini memburukkan lagi tekanan oksidatif dan mempercepatkan neurodegenerasi, sekali gus membuktikan bahawa azoospermia memberikan kematian sel. Kebolehsuaian metabolik. Ekspresi MFN2 yang teruk dapat menyelamatkan sepenuhnya PN degenerasi terminal dengan kekurangan OXPHOS yang teruk, penggunaan DNA mitokondria yang besar, dan rangkaian mitokondria yang nampaknya rosak, yang seterusnya menekankan bahawa bentuk neurodegenerasi ini juga boleh pulih pada peringkat lanjut penyakit sebelum kematian sel.
Untuk menggambarkan mitokondria dalam PN kalah mati Mfn2, kami menggunakan strain tikus yang membolehkan mitokondria yang bergantung kepada Cre menyasarkan ekspresi Cre protein pendarfluor kuning (YFP) (mtYFP) (20) dan memeriksa morfologi mitokondria secara in vivo. Kami mendapati bahawa pemusnahan gen Mfn2 dalam PN akan membawa kepada pembahagian rangkaian mitokondria secara beransur-ansur (Rajah S1A), dan perubahan terawal ditemui pada usia 3 minggu. Sebaliknya, degenerasi lapisan sel PN yang ketara, seperti yang dibuktikan oleh kehilangan pewarnaan imun Calbindin, tidak bermula sehingga usia 12 minggu (Rajah 1, A dan B). Ketidakpadanan masa antara perubahan terawal dalam morfologi mitokondria dan permulaan kematian neuron yang ketara mendorong kami untuk menyiasat perubahan metabolik yang dicetuskan oleh disfungsi mitokondria sebelum kematian sel. Kami membangunkan strategi berasaskan pengisihan sel yang diaktifkan pendarfluor (FACS) untuk mengasingkan PN yang mengekspresikan YFP (YFP+) (Rajah 1C), dan pada tikus kawalan (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), selepas ini dirujuk sebagai CTRL (Rajah S1B). Pengoptimuman strategi gating berdasarkan keamatan relatif isyarat YFP membolehkan kami menulenkan badan YFP+ (YFPhigh) PN daripada bukan PN (YFPneg) (Rajah S1B) atau serpihan akson/dendritik pendarfluor putatif (YFPlow; Rajah S1D, kiri), yang disahkan oleh mikroskop konfokal (Rajah S1D, kanan). Untuk mengesahkan identiti populasi yang dikelaskan, kami menjalankan proteomik LFQ dan kemudian analisis komponen utama, dan mendapati terdapat pemisahan yang jelas antara sel YFPhigh dan YFPneg (Rajah S1C). Sel YFPhigh menunjukkan pengayaan bersih penanda PN yang diketahui (iaitu Calb1, Pcp2, Grid2 dan Itpr3) (21, 22), tetapi tiada pengayaan protein yang biasa diekspresikan dalam neuron atau jenis sel lain (Rajah 1D)). Perbandingan antara sampel dalam sel YFPhigh terkelas yang dikumpulkan dalam eksperimen bebas menunjukkan pekali korelasi > 0.9, menunjukkan kebolehulangan yang baik antara replika biologi (Rajah S1E). Secara ringkasnya, data ini mengesahkan rancangan kami untuk pengasingan akut dan spesifik PN yang boleh dilaksanakan. Oleh kerana sistem pemacu L7-cre yang digunakan mendorong penggabungan semula mozek pada minggu pertama selepas bersalin (23), kami mula memusnahkan tikus daripada CTRL dan bersyarat (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kumpulkan neuron. Selepas penggabungan semula selesai, ia dipanggil Mfn2cKO pada usia 4 minggu. Sebagai titik akhir, kami memilih usia 8 minggu apabila lapisan PN masih utuh walaupun terdapat pemecahan mitokondria yang jelas (Rajah 1B dan Rajah S1A). Secara keseluruhan, kami mengukur sejumlah 3013 protein, yang mana kira-kira 22% adalah berdasarkan anotasi MitoCarta 2.0 berdasarkan proteom mitokondria sebagai mitokondria (Rajah 1E) (Rajah 1E) (24). Analisis ekspresi gen pembezaan yang dilakukan pada minggu ke-8 menunjukkan bahawa hanya 10.5% daripada semua protein mempunyai perubahan ketara (Rajah 1F dan Rajah S1F), yang mana 195 protein dikurangkan dan 120 protein dinaikkan (Rajah 1F). Perlu diingatkan bahawa "analisis laluan inovatif" set data ini menunjukkan bahawa gen yang diekspresikan secara berbeza terutamanya tergolong dalam set laluan metabolik tertentu yang terhad (Rajah 1G). Menariknya, walaupun penurunan regulasi laluan yang berkaitan dengan OXPHOS dan isyarat kalsium mengesahkan induksi disfungsi mitokondria dalam PN kekurangan pelakuran, kategori lain yang terutamanya melibatkan metabolisme asid amino dikawal selia dengan ketara, yang selaras dengan metabolisme yang berlaku dalam PN mitokondria. Pendawaian semula adalah konsisten.
(A) Gambar confocal perwakilan bahagian serebelum tikus CTRL dan Mfn2cKO yang menunjukkan kehilangan PN secara progresif (calbindin, kelabu); nukleus telah diwarnakan semula dengan DAPI. (B) Kuantifikasi (A) (analisis varians sehala, ***P<0.001; n = 4 hingga 6 bulatan daripada tiga tikus). (C) Aliran kerja eksperimen. (D) Taburan peta haba penanda khusus untuk Purkinje (atas) dan jenis sel lain (tengah). (E) Gambar rajah Venn yang menunjukkan bilangan protein mitokondria yang dikenal pasti dalam PN terkelas. (F) Plot gunung berapi protein yang diekspresikan secara berbeza dalam neuron Mfn2cKO pada 8 minggu (nilai pemotongan signifikan 1.3). (G) Analisis laluan kreativiti menunjukkan lima laluan peningkatan regulasi (merah) dan penurunan regulasi (biru) yang paling penting dalam PN Mfn2cKO yang dikelaskan sebagai 8 minggu. Tahap ekspresi purata setiap protein yang dikesan ditunjukkan. Peta haba skala kelabu: nilai P terlaras. ns, tidak penting.
Data proteomik menunjukkan bahawa ekspresi protein kompleks I, III, dan IV secara beransur-ansur menurun. Kompleks I, III, dan IV semuanya mengandungi subunit penting yang dikodkan mtDNA, manakala kompleks II, yang hanya dikodkan nuklear, pada dasarnya tidak terjejas (Rajah 2A dan Rajah S2A). . Selaras dengan keputusan proteomik, imunohistokimia bahagian tisu serebelum menunjukkan bahawa tahap subunit MTCO1 (subunit oksidase sitokrom C mitokondria 1) bagi kompleks IV dalam PN secara beransur-ansur menurun (Rajah 2B). Subunit Mtatp8 yang dikodkan mtDNA berkurangan dengan ketara (Rajah S2A), manakala tahap keadaan mantap subunit sintase ATP yang dikodkan nuklear kekal tidak berubah, yang konsisten dengan kompleks F1 subassembly sintase ATP stabil yang diketahui apabila ekspresi mtDNA stabil. Pembentukannya konsisten. Interrupt (7). Penilaian tahap mtDNA dalam PN Mfn2cKO yang disusun melalui tindak balas rantai polimerase masa nyata (qPCR) mengesahkan penurunan secara beransur-ansur dalam bilangan salinan mtDNA. Berbanding dengan kumpulan kawalan, pada usia 8 minggu, hanya kira-kira 20% daripada tahap mtDNA dikekalkan (Rajah 2C). Selaras dengan keputusan ini, pewarnaan mikroskopi konfokal PN Mfn2cKO digunakan untuk mengesan DNA, menunjukkan penggunaan nukleotida mitokondria yang bergantung pada masa (Rajah 2D). Kami mendapati bahawa hanya beberapa calon yang terlibat dalam degradasi protein mitokondria dan tindak balas tekanan telah dikawal selia, termasuk Lonp1, Afg3l2 dan Clpx, dan faktor pemasangan kompleks OXPHOS. Tiada perubahan ketara dalam tahap protein yang terlibat dalam apoptosis dikesan (Rajah S2B). Begitu juga, kami mendapati bahawa mitokondria dan saluran retikulum endoplasma yang terlibat dalam pengangkutan kalsium hanya mempunyai perubahan kecil (Rajah S2C). Di samping itu, penilaian protein berkaitan autofagi tidak menemui perubahan ketara, yang selaras dengan induksi autofagosom yang boleh dilihat yang diperhatikan secara in vivo oleh imunohistokimia dan mikroskop elektron (Rajah S3). Walau bagaimanapun, disfungsi OXPHOS progresif dalam PN disertai dengan perubahan mitokondria ultrastruktur yang jelas. Gugusan mitokondria boleh dilihat dalam badan sel dan pokok dendritik PN Mfn2cKO berumur 5 dan 8 minggu, dan struktur membran dalaman telah mengalami perubahan yang mendalam (Rajah S4, A dan B). Selaras dengan perubahan ultrastruktur ini dan penurunan ketara dalam mtDNA, analisis hirisan serebelum serebrum akut dengan tetrametilrhodamin metil ester (TMRM) menunjukkan bahawa potensi membran mitokondria dalam PN Mfn2cKO menurun dengan ketara (Rajah S4C).
(A) Analisis jangka masa tahap ekspresi kompleks OXPHOS. Hanya pertimbangkan protein dengan P<0.05 pada 8 minggu (ANOVA dua hala). Garis putus-putus: Tiada pelarasan berbanding CTRL. (B) Kiri: Contoh keratan serebelum yang dilabel dengan antibodi anti-MTCO1 (bar skala, 20 μm). Kawasan yang diduduki oleh badan sel Purkinje diliputi oleh warna kuning. Kanan: Kuantifikasi tahap MTCO1 (analisis varians sehala; n = 7 hingga 20 sel yang dianalisis daripada tiga tikus). (C) Analisis qPCR bagi nombor salinan mtDNA dalam PN yang disusun (analisis varians sehala; n = 3 hingga 7 tikus). (D) Kiri: Contoh hirisan serebelum yang dilabel dengan antibodi anti-DNA (bar skala, 20 μm). Kawasan yang diduduki oleh badan sel Purkinje diliputi oleh warna kuning. Kanan: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians sehala; n = 5 hingga 9 sel daripada tiga tikus). (E) Satu contoh keratan serebelum akut yang menunjukkan sel mitoYFP + Purkinje (anak panah) dalam rakaman pengapit tampalan seluruh sel. (F) Kuantifikasi lengkung IV. (G) Rakaman perwakilan suntikan arus depolarisasi dalam sel CTRL dan Mfn2cKO Purkinje. Jejak atas: Nadi pertama yang mencetuskan AP. Jejak bawah: Frekuensi AP maksimum. (H) Kuantifikasi input spontan pascasinaptik (sPSP). Jejak rakaman perwakilan dan nisbah zumnya ditunjukkan dalam (I). Analisis varians sehala dianalisis n = 5 hingga 20 sel daripada tiga tikus. Data dinyatakan sebagai min±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Jejak perwakilan AP spontan yang dirakam menggunakan mod pengapit tampalan berlubang. Jejak atas: Frekuensi AP maksimum. Jejak bawah: zum AP tunggal. (K) Kuantifikasi frekuensi AP purata dan maksimum mengikut (J). Ujian Mann-Whitney; n = 5 sel dianalisis daripada empat tikus. Data dinyatakan sebagai min ± SEM; tidak penting.
Kerosakan OXPHOS yang jelas dikesan dalam PN Mfn2cKO yang berusia 8 minggu, menunjukkan bahawa fungsi fisiologi neuron adalah sangat tidak normal. Oleh itu, kami menganalisis ciri-ciri elektrik pasif neuron kekurangan OXPHOS pada 4 hingga 5 minggu dan 7 hingga 8 minggu dengan melakukan rakaman pengapit tampalan seluruh sel dalam hirisan serebelum akut (Rajah 2E). Tanpa diduga, purata potensi membran rehat dan rintangan input neuron Mfn2cKO adalah serupa dengan kawalan, walaupun terdapat perbezaan yang halus antara sel (Jadual 1). Begitu juga, pada usia 4 hingga 5 minggu, tiada perubahan ketara dalam hubungan arus-voltan (lengkung IV) ditemui (Rajah 2F). Walau bagaimanapun, tiada neuron Mfn2cKO yang berusia 7 hingga 8 minggu terselamat daripada rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), menunjukkan bahawa terdapat kepekaan yang jelas terhadap potensi hiperpolarisasi pada peringkat akhir ini. Sebaliknya, dalam neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi yang menyebabkan pelepasan potensi tindakan berulang (AP) boleh diterima dengan baik, menunjukkan bahawa corak pelepasan keseluruhannya tidak berbeza secara signifikan daripada neuron kawalan berusia 8 minggu (Jadual 1 dan Rajah 2G). Begitu juga, frekuensi dan amplitud arus pascasinaptik spontan (sPSC) adalah setanding dengan kumpulan kawalan, dan kekerapan peristiwa meningkat dari 4 minggu hingga 5 minggu hingga 7 minggu hingga 8 minggu dengan peningkatan yang serupa (Rajah 2, H dan I). Tempoh kematangan sinaptik dalam PN (25). Keputusan yang serupa diperoleh selepas tampalan PN berlubang. Konfigurasi ini menghalang kemungkinan pampasan kecacatan ATP selular, seperti yang mungkin berlaku dalam rakaman pengapit tampalan seluruh sel. Khususnya, potensi membran rehat dan frekuensi pembakaran spontan neuron Mfn2cKO tidak terjejas (Rajah 2, J dan K). Secara ringkasnya, keputusan ini menunjukkan bahawa PN dengan disfungsi OXPHOS yang jelas boleh menangani corak nyahcas frekuensi tinggi dengan baik, menunjukkan bahawa terdapat mekanisme pampasan yang membolehkannya mengekalkan tindak balas elektrofisiologi yang hampir normal.
Data dinyatakan sebagai min ± SEM (analisis varians sehala, ujian perbandingan berganda Holm-Sidak; *P<0.05). Nombor unit ditunjukkan oleh kurungan.
Kami berhasrat untuk menyiasat sama ada mana-mana kategori dalam set data proteomik (Rajah 1G) merangkumi laluan yang boleh mengatasi kekurangan OXPHOS yang teruk, sekali gus menjelaskan mengapa PN yang terjejas boleh mengekalkan elektrofisiologi hampir normal (Rajah 2, E hingga K). Analisis proteomik menunjukkan bahawa enzim yang terlibat dalam katabolisme asid amino rantai bercabang (BCAA) telah meningkat dengan ketara (Rajah 3A dan Rajah S5A), dan produk akhir asetil-CoA (CoA) atau suksinil CoA boleh menambah trikarboksilat dalam kitaran Asid arteriosklerosis (TCA). Kami mendapati bahawa kandungan BCAA transaminase 1 (BCAT1) dan BCAT2 kedua-duanya meningkat. Ia memangkinkan langkah pertama katabolisme BCAA dengan menghasilkan glutamat daripada α-ketoglutarat (26). Semua subunit yang membentuk kompleks dehidrogenase asid keto rantai bercabang (BCKD) dikawal selia secara meningkat (kompleks ini memangkinkan penyahkarboksilan seterusnya dan tidak dapat dipulihkan bagi rangka karbon BCAA yang terhasil) (Rajah 3A dan Rajah S5A). Walau bagaimanapun, tiada perubahan ketara dalam BCAA itu sendiri ditemui dalam PN yang disusun, yang mungkin disebabkan oleh peningkatan pengambilan asid amino penting ini dalam selular atau penggunaan sumber lain (glukosa atau asid laktik) untuk menambah kitaran TCA (Rajah S5B). PN yang kekurangan OXPHOS juga menunjukkan peningkatan aktiviti penguraian dan transaminasi glutamin pada usia 8 minggu, yang boleh dicerminkan oleh peningkatan regulasi enzim mitokondria glutaminase (GLS) dan glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Rajah 3, A dan C). Perlu diingatkan bahawa peningkatan regulasi GLS adalah terhad kepada isoform glutaminase C yang disambungkan (GLS-GAC) (perubahan Mfn2cKO/CTRL adalah kira-kira 4.5 kali ganda, P = 0.05), dan peningkatan regulasi khususnya dalam tisu kanser boleh menyokong biotenaga mitokondria. (27).
(A) Peta haba menunjukkan perubahan lipatan dalam tahap protein untuk laluan yang ditentukan pada 8 minggu. (B) Contoh hirisan serebelum yang dilabel dengan antibodi anti-PCx (bar skala, 20 μm). Anak panah kuning menunjukkan badan sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein kursus masa yang dikenal pasti sebagai calon penting untuk aterosklerosis (ujian-t berganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikus). (D) Atas: Gambarajah skematik yang menunjukkan cara berbeza untuk memasukkan karbon berlabel yang terkandung dalam pengesan [1-13C]piruvat (iaitu, melalui PDH atau laluan trans-arteri). Bawah: Carta biola menunjukkan peratusan karbon berlabel tunggal (M1) yang ditukar kepada asid aspartik, asid sitrik dan asid malik selepas melabelkan hirisan serebelum akut dengan [1-13C]piruvat (ujian-t berpasangan; ** P <0.01). (E) Analisis sejarah masa yang komprehensif bagi laluan yang ditunjukkan. Hanya pertimbangkan protein dengan P<0.05 pada 8 minggu. Garis putus-putus: tiada nilai pelarasan (analisis varians dua hala; * P <0.05; *** P <0.001). Data dinyatakan sebagai min±SEM.
Dalam analisis kami, katabolisme BCAA telah menjadi salah satu laluan peningkatan regulasi utama. Fakta ini menunjukkan dengan jelas bahawa isipadu pengudaraan yang memasuki kitaran TCA mungkin berubah dalam PN yang kekurangan OXPHOS. Ini mungkin mewakili bentuk utama pendawaian semula metabolik neuron, yang mungkin mempunyai kesan langsung terhadap fisiologi neuron dan kelangsungan hidup semasa pengekalan disfungsi OXPHOS yang teruk. Selaras dengan hipotesis ini, kami mendapati bahawa enzim anti-aterosklerotik utama PCx dikawal selia dengan lebih baik (Mfn2cKO/CTRL berubah kira-kira 1.5 kali; Rajah 3A), yang memangkinkan penukaran piruvat kepada oksaloasetat (28), yang dipercayai berada dalam tisu otak. Ekspresi dalam adalah terhad kepada astrosit (29, 30). Selaras dengan keputusan proteomik, mikroskopi confocal menunjukkan bahawa ekspresi PCx meningkat secara khusus dan ketara dalam PN yang kekurangan OXPHOS, manakala kereaktifan PCx terutamanya terhad kepada sel glial Bergmann bersebelahan kawalan (Rajah 3B). Untuk menguji secara fungsional peningkatan regulasi PCx yang diperhatikan, kami merawat hirisan serebelum akut dengan penjejak [1-13C]piruvat. Apabila piruvat dioksidakan oleh piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopnya hilang, tetapi digabungkan ke dalam perantara kitaran TCA apabila piruvat dimetabolismekan melalui tindak balas vaskular (Rajah 3D). Bagi menyokong data proteomik kami, kami memerhatikan sebilangan besar penanda daripada penjejak ini dalam asid aspartik hirisan Mfn2cKO, manakala asid sitrik dan asid malik juga mempunyai trend sederhana, walaupun tidak ketara (Rajah 3D).
Dalam neuron dopamin tikus MitoPark dengan disfungsi mitokondria yang disebabkan oleh neuron dopamin yang secara khusus memusnahkan gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Rajah S6B), ekspresi PCx juga meningkat dengan ketara (31), menunjukkan bahawa kejadian penyakit arteriosklerosis asid aseton dikawal selia semasa disfungsi OXPHOS neuron dalam badan. Perlu diingatkan bahawa telah didapati bahawa enzim unik (32-34) yang mungkin diekspresikan dalam neuron yang mungkin dikaitkan dengan arteriosklerosis meningkat dengan ketara dalam PN yang kekurangan OXPHOS, seperti propionil-CoA karboksilase (PCC-A), Malonil-CoA menukar propionil-CoA kepada suksinil-CoA dan enzim malik mitokondria 3 (ME3), yang peranan utamanya adalah untuk mendapatkan semula piruvat daripada malat (Rajah 3, A dan C) (33, 35). Di samping itu, kami mendapati peningkatan yang ketara dalam enzim Pdk3, yang memfosforilasi dan seterusnya menyahaktifkan PDH (36), manakala tiada perubahan dikesan dalam enzim Pdp1 yang mengaktifkan PDH atau kompleks enzim PDH itu sendiri (Rajah 3A). Secara konsisten, dalam PN Mern2cKO, fosforilasi subunit α1 α (PDHE1α) subunit komponen piruvat dehidrogenase E1 bagi kompleks PDH dalam Ser293 (diketahui menghalang aktiviti enzim PDH) telah dipertingkatkan (Rajah S6C) (Rajah S6C). Piruvat tidak mempunyai akses vaskular.
Akhirnya, kami mendapati bahawa laluan super biosintesis serina dan glisina, kitaran folat mitokondria (1C) yang berkaitan dan biosintesis prolina (Rajah 1G dan Rajah S5C) semuanya meningkat dengan ketara, menurut laporan, semasa proses pengaktifan. Tisu-tisu di sekeliling diaktifkan dengan disfungsi mitokondria (5-7). Analisis confocal yang menyokong data proteomik ini menunjukkan bahawa dalam PN dengan OXPHOS yang hilang, hirisan cerebellar tikus berusia 8 minggu telah menjalani serina hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim utama kitaran folat mitokondria. Tindak balas imun yang ketara (Rajah S5D). Dalam 13 hirisan cerebellar akut yang diinkubasi oleh CU-glukosa, eksperimen pengesanan metabolik mengesahkan lagi peningkatan regulasi biosintesis serina dan prolina, menunjukkan bahawa fluks isoform karbon ke dalam serina dan prolina meningkat (Rajah S5E). Oleh kerana tindak balas yang dipromosikan oleh GLS dan GPT2 bertanggungjawab untuk sintesis glutamat daripada glutamin dan transaminasi antara glutamat dan α-ketoglutarat, peningkatan regulasi mereka menunjukkan bahawa neuron kekurangan OXPHOS mempunyai peningkatan permintaan untuk glutamat. Ini mungkin bertujuan untuk mengekalkan peningkatan biosintesis prolin (Rajah S5C). Berbeza dengan perubahan ini, analisis proteomik astrosit serebelum daripada tikus Mfn2cKO khusus PN menunjukkan bahawa laluan ini (termasuk semua antiperoksidase) tidak berubah dengan ketara dalam ekspresi, sekali gus menunjukkan pengalihan metabolik ini adalah selektif kepada PN yang terdegradasi (Rajah S6, D hingga G).
Secara ringkasnya, analisis ini mendedahkan corak pengaktifan temporal laluan metabolik tertentu dalam PN yang berbeza dengan ketara. Walaupun fungsi mitokondria neuron yang tidak normal boleh menyebabkan aterosklerosis awal dan pembentukan semula 1C (Rajah 3E dan Rajah S5C), dan juga perubahan yang boleh diramal dalam ekspresi kompleks I dan IV, perubahan dalam sintesis serina de novo hanya menjadi jelas pada peringkat akhir. Disfungsi OXPHOS (Rajah 3E dan Rajah S5C). Penemuan ini mentakrifkan proses berjujukan di mana mitokondria (kitaran 1C) dan sitoplasma (biosintesis serina) yang disebabkan oleh tekanan bertindak balas secara sinergistik dengan peningkatan aterosklerosis dalam kitaran TCA untuk membentuk semula metabolisme neuron.
PN kekurangan OXPHOS berusia 8 minggu boleh mengekalkan aktiviti pengujaan frekuensi tinggi dan menjalani penyambungan semula metabolik yang ketara untuk mengimbangi disfungsi mitokondria. Penemuan ini menimbulkan kemungkinan menarik bahawa walaupun pada masa ini, sel-sel ini juga mungkin menerima intervensi terapeutik untuk melambatkan atau mencegah neurodegenerasi. Lewat. Kami menyelesaikan kemungkinan ini melalui dua intervensi bebas. Dalam kaedah pertama, kami mereka bentuk vektor virus berkaitan adeno (AAV) yang bergantung kepada Cre supaya MFN2 boleh diekspresikan secara selektif dalam PN kekurangan OXPHOS secara in vivo (Rajah S7A). Pengekodan AAV MFN2 dan gen reporter pendarfluor mCherry (Mfn2-AAV) telah disahkan dalam kultur neuron primer secara in vitro, yang menyebabkan MFN2 diekspresikan secara bergantung kepada Cre dan menyelamatkan morfologi mitokondria, sekali gus mencegah neuromutasi dalam neuron Mfn2cKO (Rajah S7, B, D dan E). Seterusnya, kami menjalankan eksperimen in vivo untuk menghantar Mfn2-AAV berusia 8 minggu secara stereotaktik ke korteks serebelar Mfn2cKO dan tikus kawalan, dan menganalisis tikus berusia 12 minggu (Rajah 4A). Tikus Mfn2cKO yang dirawat mati (Rajah 1, A dan B) (16). Transduksi virus in vivo menghasilkan ekspresi selektif PN dalam beberapa bulatan serebelar (Rajah S7, G dan H). Suntikan AAV kawalan yang hanya mengekspresikan mCherry (Ctrl-AAV) tidak mempunyai kesan yang ketara terhadap tahap neurodegenerasi dalam haiwan Mfn2cKO. Sebaliknya, analisis Mfn2cKO yang ditransduksi dengan Mfn2-AAV menunjukkan kesan perlindungan yang ketara pada lapisan sel PN (Rajah 4, B dan C). Khususnya, ketumpatan neuron nampaknya hampir tidak dapat dibezakan daripada haiwan kawalan (Rajah 4, B dan C, dan Rajah S7, H dan I). Ekspresi MFN1 tetapi bukan MFN2 adalah sama berkesan dalam menyelamatkan kematian neuron (Rajah 4C dan Rajah S7, C dan F), yang menunjukkan bahawa ekspresi MFN1 ektopik boleh menambah kekurangan MFN2 dengan berkesan. Analisis lanjut pada tahap PN tunggal menunjukkan bahawa Mfn2-AAV sebahagian besarnya menyelamatkan ultrastruktur mitokondria, menormalkan tahap mtDNA, dan membalikkan ekspresi tinggi penanda anti-angiogenesis PCx (Rajah 4, C hingga E). Pemeriksaan visual tikus Mfn2cKO yang diselamatkan dalam keadaan rehat menunjukkan bahawa postur dan gejala motor mereka (pergerakan S1 hingga S3) telah bertambah baik. Kesimpulannya, eksperimen ini menunjukkan bahawa pengenalan semula MFN2 yang tertangguh ke dalam PN yang sangat kekurangan OXPHOS adalah mencukupi untuk membalikkan penggunaan mtDNA dan mendorong aterosklerosis, sekali gus mencegah degenerasi akson dan kematian neuron secara in vivo.
(A) Skema yang menunjukkan jadual eksperimen untuk menyuntik pengekodan AAV MFN2 apabila laluan metabolik yang ditunjukkan diaktifkan. (B) Imej confocal perwakilan hirisan serebelar berusia 12 minggu yang ditransduksi pada 8 minggu dalam tikus Mfn2cKO dan dilabelkan dengan antibodi anti-Calbindin. Kanan: Penskalaan gentian akson. Skala zum akson ialah 450 dan 75 μm. (C) Kiri: Kuantifikasi ketumpatan sel Purkinje dalam gelung transduksi AAV (AAV+) (analisis varians sehala; n = 3 tikus). Kanan: analisis fokus mtDNA dalam PN yang ditransduksi pada minggu ke-12 (ujian-t tidak berpasangan; n = 6 sel daripada tiga tikus). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrograf elektron penghantaran perwakilan PN bahagian serebelar Mfn2cKO yang ditransduksi dengan vektor virus yang ditunjukkan. Topeng merah jambu menggambarkan kawasan yang diduduki oleh dendrit, dan segi empat sama bertitik kuning menggambarkan zum yang disediakan di sebelah kanan; n mewakili nukleus. Bar skala, 1μm. (E) menunjukkan contoh pewarnaan PCx dalam PN yang ditransduksi pada 12 minggu. Bar skala, 20μm. OE, ekspresi berlebihan; FC, perubahan lipatan.
Akhir sekali, kami mengkaji kepentingan kemandirian sel yang disebabkan oleh peroksidase dalam PN yang telah mengalami disfungsi OXPHOS. Kami menghasilkan pengekodan mCherry AAV-shRNA (RNA jepit rambut pendek) yang khusus menyasarkan mRNA PCx tikus (AAV-shPCx), dan menyuntik virus atau kawalan teracaknya (AAV-scr) ke dalam serebelum tikus Mfn2cKO. Suntikan dilakukan pada minggu keempat usia (Rajah 5A) untuk mencapai penurunan PCx yang berkesan semasa tempoh apabila ekspresi PCx meningkat (Rajah 3C) dan lapisan sel PN masih utuh (Rajah 1A). Perlu diingatkan bahawa penurunan PCx (Rajah S8A) membawa kepada pecutan kematian PN yang ketara, yang terhad kepada cincin yang dijangkiti (Rajah 5, B dan C). Untuk memahami mekanisme kesan metabolik yang disebabkan oleh peningkatan regulasi PCx, kami mengkaji status redoks PN selepas PCx ​​knockdown dan biosensor optik yang dimediasi AAV Grx1-roGFP2 diekspresikan secara serentak (Rajah S8, B hingga D) untuk menilai perubahan relatif potensi redoks peptida glutation (38). Kemudian, kami melakukan mikroskopi pengimejan seumur hidup pendarfluor dua foton (FLIM) dalam hirisan otak akut Mfn2cKO berusia 7 minggu atau rakan sebaya kawalan untuk mengesan potensi perubahan dalam status redoks sitoplasma selepas mengesahkan keadaan FLIM (Rajah S8, E hingga G). Analisis menunjukkan peningkatan ketara dalam keadaan pengoksidaan PN Mfn2cKO tunggal yang kekurangan ekspresi PCx, yang berbeza daripada neuron kawalan atau PN Mfn2cKO yang hanya mengekspresikan shRNA teracak (Rajah 5, D dan E). Apabila ekspresi PCx dikawal selia secara menurun, peratusan PN Mfn2cKO yang menunjukkan keadaan teroksidasi tinggi meningkat lebih daripada tiga kali ganda (Rajah 5E), menunjukkan bahawa peningkatan regulasi PCx mengekalkan kapasiti redoks neuron yang terdegenerasi.
(A) Skema yang menunjukkan jadual eksperimen untuk menyuntik pengekodan AAV shPCx apabila laluan metabolik yang ditunjukkan diaktifkan. (B) Gambar confocal perwakilan bahagian serebelum berusia 8 minggu dalam tikus Mfn2cKO yang ditransduksi dan dilabelkan dengan antibodi anti-kalsineurin pada 4 minggu. Bar skala, 450μm. (C) Kuantifikasi ketumpatan sel Purkinje dalam gelung transduksi AAV (analisis varians sehala; n = 3 hingga 4 tikus). Data dinyatakan sebagai min±SEM; ***P<0.001. (D) Gambar FLIM perwakilan menunjukkan jangka hayat purata sensor glutation redoks Grx1-roGFP2 yang mengekspresikan PN berusia 7 minggu di bawah keadaan eksperimen yang ditentukan. Nisbah LUT (jadual carian): selang masa kemandirian (dalam pikosaat). Bar skala, 25μm. (E) Histogram menunjukkan taburan nilai hayat Grx1-roGFP2 daripada (D) (n=158 hingga 368 sel dalam dua ekor tikus di bawah setiap keadaan). Carta pai di atas setiap histogram: menunjukkan bilangan sel dengan nilai hayat yang jauh lebih panjang (merah, teroksida) atau lebih pendek (biru, berkurangan), yang melebihi 1 SD daripada nilai hayat purata dalam CTRL-AAV-scr. (F) Model yang dicadangkan menunjukkan kesan perlindungan peningkatan regulasi PCx neuron.
Secara keseluruhannya, data yang kami berikan di sini menunjukkan bahawa ekspresi semula MFN2 dapat menyelamatkan sepenuhnya PN peringkat lanjut dengan kekurangan OXPHOS yang teruk, penipisan mtDNA yang teruk, dan morfologi seperti ista yang sangat tidak normal, sekali gus memberikan kemajuan berterusan walaupun dalam penyakit peringkat lanjut. Neurodegenerasi memberikan bukti boleh balik bagi peringkat sebelum kematian sel. Tahap fleksibiliti metabolik ini ditekankan lagi oleh keupayaan neuron untuk mendorong aterosklerosis (pendawaian semula kitaran TCA), yang menghalang ekspresi PCx dalam PN yang kekurangan OXPHOS dan meningkatkan kematian sel, sekali gus memainkan peranan perlindungan (Rajah 5F).
Dalam kajian ini, kami memberikan bukti bahawa tindak balas PN terhadap disfungsi OXPHOS adalah secara beransur-ansur menumpu kepada aterosklerosis kitaran TCA melalui laluan pengaktifan pembezaan yang diaktifkan oleh program metabolik. Kami mengesahkan analisis proteomik dengan banyak kaedah pelengkap dan mendedahkan bahawa apabila dicabar oleh disfungsi mitokondria yang teruk, neuron mempunyai bentuk keanjalan metabolik yang sebelum ini tidak diketahui. Mengejutkan kami, keseluruhan proses pendawaian semula tidak semestinya menandakan keadaan metabolik terminal yang mengiringi neurodegenerasi secara beransur-ansur dan tidak dapat dipulihkan, tetapi data kami menunjukkan bahawa ia mungkin merupakan neuron penyelenggaraan walaupun pada peringkat sebelum kematian sel Mekanisme pampasan berfungsi. Penemuan ini menunjukkan bahawa neuron mempunyai tahap keplastikan metabolik yang ketara dalam badan. Fakta ini membuktikan bahawa pengenalan semula MFN2 kemudian boleh membalikkan ekspresi penanda metabolik utama dan mencegah degenerasi PN. Sebaliknya, ia menghalang aterosklerosis dan mempercepatkan saraf. transeksual.
Salah satu penemuan paling menarik dalam penyelidikan kami ialah PN yang kekurangan OXPHOS boleh mengubah metabolisme kitaran TCA dengan meningkatkan enzim yang secara khusus merangsang arteriosklerosis. Penyusunan semula metabolik adalah ciri umum sel kanser, yang sebahagiannya bergantung pada glutamin untuk menambah perantaraan kitaran TCA untuk menghasilkan setara pengurangan, yang memacu rantai pernafasan dan mengekalkan penghasilan prekursor biosintesis lipid dan nukleotida (39, 40). Satu kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa dalam tisu periferi yang mengalami disfungsi OXPHOS, penyambungan semula metabolisme glutamin/glutamat juga merupakan ciri yang menonjol (5, 41), di mana arah kemasukan glutamin ke dalam kitaran TCA bergantung kepada Kerana keterukan kecederaan OXPHOS (41). ). Walau bagaimanapun, terdapat kekurangan bukti yang jelas tentang sebarang persamaan keplastikan metabolik neuron dalam badan dan kemungkinan kaitannya dalam konteks penyakit. Dalam kajian in vitro baru-baru ini, neuron kortikal primer ditunjukkan untuk menggerakkan kolam glutamat untuk neurotransmisi, sekali gus menggalakkan metabolisme oksidatif dan aterosklerosis di bawah keadaan tekanan metabolik (42). Perlu diingatkan bahawa di bawah perencatan farmakologi enzim kitaran TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat dipercayai mengekalkan sintesis oksaloasetat dalam neuron granul serebelum yang dikultur (34). Walau bagaimanapun, kaitan fisiologi mekanisme ini dengan tisu otak (di mana aterosklerosis dipercayai terhad kepada astrosit) masih mempunyai kepentingan fisiologi yang penting (43). Dalam kes ini, data kami menunjukkan bahawa PN yang rosak oleh OXPHOS dalam badan boleh ditukar kepada degradasi BCAA dan karboksilasi piruvat, yang merupakan dua sumber utama suplemen perantaraan kumpulan TCA. Walaupun sumbangan putatif katabolisme BCAA kepada metabolisme tenaga neuron telah dicadangkan, sebagai tambahan kepada peranan glutamat dan GABA untuk neurotransmisi (44), masih tiada bukti untuk mekanisme ini secara in vivo. Oleh itu, mudah untuk membuat spekulasi bahawa PN yang tidak berfungsi secara automatik boleh mengimbangi penggunaan perantaraan TCA yang didorong oleh proses asimilasi dengan meningkatkan aterosklerosis. Khususnya, peningkatan regulasi PCx mungkin diperlukan untuk mengekalkan peningkatan permintaan untuk asid aspartik, yang dicadangkan dalam sel yang membiak dengan disfungsi mitokondria (45). Walau bagaimanapun, analisis metabolomik kami tidak mendedahkan sebarang perubahan ketara dalam tahap keadaan mantap asid aspartik dalam Mfn2cKO PN (Rajah S6A), yang mungkin mencerminkan penggunaan metabolik asid aspartik yang berbeza antara sel yang membiak dan neuron pasca-mitosis. Walaupun mekanisme tepat peningkatan regulasi PCx dalam neuron yang tidak berfungsi secara in vivo masih perlu dicirikan, kami menunjukkan bahawa tindak balas pramatang ini memainkan peranan penting dalam mengekalkan keadaan redoks neuron, yang ditunjukkan dalam eksperimen FLIM pada kepingan serebelum. Khususnya, mencegah PN daripada meningkatkan regulasi PCx boleh menyebabkan keadaan yang lebih teroksida dan mempercepatkan kematian sel. Pengaktifan degradasi BCAA dan karboksilasi piruvat bukanlah cara untuk mencirikan tisu periferi disfungsi mitokondria (7). Oleh itu, ia seolah-olah menjadi ciri keutamaan neuron kekurangan OXPHOS, walaupun bukan satu-satunya ciri, yang penting untuk neurodegenerasi. .
Penyakit serebelum merupakan sejenis penyakit neurodegeneratif heterogen yang biasanya menunjukkan dirinya sebagai ataksia dan sering merosakkan PN (46). Populasi neuron ini amat terdedah kepada disfungsi mitokondria kerana degenerasi selektifnya pada tikus mencukupi untuk menghasilkan semula banyak gejala motor yang mencirikan ataksia spinocerebelum manusia (16, 47, 48). Menurut laporan, model tikus transgenik dengan gen mutan dikaitkan dengan ataksia spinocerebelum manusia dan mempunyai disfungsi mitokondria (49, 50), menekankan kepentingan mengkaji akibat kekurangan OXPHOS dalam PNPH. Oleh itu, amat sesuai untuk mengasingkan dan mengkaji populasi neuron unik ini secara berkesan. Walau bagaimanapun, memandangkan PN sangat sensitif terhadap tekanan dan menyumbang kepada sebahagian kecil daripada keseluruhan populasi sel serebelum, bagi banyak kajian berasaskan omics, pemisahan selektifnya sebagai sel keseluruhan masih merupakan aspek yang mencabar. Walaupun hampir mustahil untuk mencapai ketiadaan pencemaran sepenuhnya terhadap jenis sel lain (terutamanya tisu dewasa), kami menggabungkan langkah penceraian yang berkesan dengan FACS untuk mendapatkan bilangan neuron yang berdaya maju yang mencukupi untuk analisis proteomik hiliran, dan mempunyai liputan protein yang agak tinggi (kira-kira 3000 protein) berbanding set data sedia ada bagi keseluruhan serebelum (51). Dengan memelihara daya maju keseluruhan sel, kaedah yang kami sediakan di sini membolehkan kami bukan sahaja menyemak perubahan dalam laluan metabolik dalam mitokondria, tetapi juga menyemak perubahan dalam rakan sejawat sitoplasmanya, yang melengkapi penggunaan tag membran mitokondria untuk memperkayakan jenis sel. Kaedah baharu untuk bilangan mitokondria dalam tisu kompleks (52, 53). Kaedah yang kami huraikan bukan sahaja berkaitan dengan kajian sel Purkinje, tetapi boleh digunakan dengan mudah pada sebarang jenis sel untuk menangani perubahan metabolik dalam otak yang berpenyakit, termasuk model disfungsi mitokondria yang lain.
Akhir sekali, kami telah mengenal pasti tetingkap terapeutik semasa proses penyusunan semula metabolik ini yang boleh membalikkan sepenuhnya tanda-tanda utama tekanan selular dan mencegah degenerasi neuron. Oleh itu, memahami implikasi fungsi pendawaian semula yang diterangkan di sini boleh memberikan pandangan asas tentang kemungkinan rawatan untuk mengekalkan daya maju neuron semasa disfungsi mitokondria. Penyelidikan masa depan yang bertujuan untuk membedah perubahan dalam metabolisme tenaga dalam jenis sel otak lain diperlukan untuk mendedahkan sepenuhnya kebolehgunaan prinsip ini kepada penyakit neurologi lain.
Tikus MitoPark telah diterangkan sebelum ini (31). Tikus C57BL/6N dengan gen Mfn2 yang mengapit loxP telah diterangkan sebelum ini (18) dan dikacukkan dengan tikus L7-Cre (23). Keturunan heterozigot berganda yang terhasil kemudiannya dikacukkan dengan tikus Mfn2loxP/Mfn2loxP homozigot untuk menghasilkan knockout gen khusus Purkinje untuk Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Dalam subset perkahwinan, alel SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) (stop-mtYFP) diperkenalkan melalui kacukan tambahan (20). Semua prosedur haiwan telah dijalankan mengikut garis panduan Eropah, kebangsaan dan institusi dan diluluskan oleh LandesamtfürNatur dari Umwelt dan Verbraucherschutz, Rhine-Westphalia Utara, Jerman. Kerja haiwan juga mengikuti panduan Persekutuan Persatuan Sains Haiwan Makmal Eropah.
Selepas membius dislokasi serviks wanita hamil, embrio tikus diasingkan (E13). Korteks dibedah dalam Larutan Garam Seimbang Hanks (HBSS) yang ditambah dengan 10 mM Hepes dan disalurkan ke Medium Dulbecco's Modified Eagle's yang mengandungi papain (20 U/ml) dan sistein (1μg/ml). Inkubasi tisu dalam DMEM) dan asingkannya melalui pencernaan enzimatik. Ml) pada suhu 37°C selama 20 minit, dan kemudian digiling secara mekanikal dalam DMEM yang ditambah dengan 10% serum janin lembu. Sel-sel telah disemai pada penutup kaca yang disalut dengan polilisin pada ketumpatan 2×106 setiap piring kultur 6 cm atau pada ketumpatan 0.5×105 sel/cm2 untuk analisis pengimejan. Selepas 4 jam, medium telah digantikan dengan medium bebas serum Neurobasal yang mengandungi suplemen B27 1% dan 0.5 mM GlutaMax. Neuron-neuron tersebut kemudiannya dikekalkan pada suhu 37°C dan 5% CO2 sepanjang eksperimen, dan diberi makan sekali seminggu. Untuk mendorong penggabungan semula secara in vitro, 3μl (piring kultur 24-telaga) atau 0.5μl (plat 24-telaga) vektor virus AAV9 berikut telah digunakan untuk merawat neuron pada hari kedua secara in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nombor katalog 105530-AAV9) dan AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nombor katalog 105545-AAV9).
DNA pelengkap Mouse Mfn1 dan Mfn2 (masing-masing diperoleh daripada plasmid Addgene #23212 dan #23213) ditanda dengan jujukan V5 (GKPIPNPLLGLDST) di terminal-C, dan digabungkan dengan mCherry dalam bingkai melalui jujukan T2A. Grx1-roGFP2 ialah hadiah daripada Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Dengan menggantikan kaset tdTomato menggunakan kaedah pengklonan konvensional, kaset tersebut telah disubklon ke dalam tulang belakang pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nombor rujukan Addgene 28306) untuk menghasilkan vektor pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 dan pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Strategi yang serupa telah digunakan untuk menjana vektor kawalan pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Untuk menjana binaan AAV-shPCx, vektor plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) diperlukan, yang mengandungi jujukan DNA yang mengekod shRNA yang menyasarkan PCx tetikus (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Di bawah kawalan promoter U6, mCherry digunakan di bawah kawalan promoter CMV. Penghasilan vektor AAV tambahan telah dijalankan mengikut arahan pengilang (Cell Biolabs). Pendek kata, gunakan plasmid pemindahan yang membawa mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) secara sementara Transfeksi gen pengekod 293 sel AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) atau Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), serta pengekodan protein kapsid AAV1 dan protein aksesori. Pembungkusan plasmid, menggunakan kaedah kalsium fosfat. Supernatan virus mentah diperoleh melalui kitaran beku-cair dalam mandian ais/etanol kering dan sel yang dilisiskan dalam salin penimbal fosfat (PBS). Vektor AAV telah ditulenkan melalui ultrasentrifugasi kecerunan iodiksanol tak selanjar (24 jam pada 32,000 rpm dan 4°C) dan dipekatkan menggunakan penapis emparan Amicon ultra-15. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 salinan genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX adalah seperti yang diterangkan sebelum ini (54), diukur melalui PCR kuantitatif masa nyata (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) dan AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Neuron primer dikikis dalam 1x PBS yang sejuk, dipel, dan kemudian dihomogenkan dalam penimbal lisis Triton X-100 / 0.5% natrium deoksikolat/PBS yang mengandungi fosfatase dan perencat protease (Roche). Pengiraan protein dilakukan menggunakan ujian asid bikinchoninik (Thermo Fisher Scientific). Protein kemudiannya dipisahkan melalui elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, dan kemudian ditiup ke atas membran polivinilidena fluorida (GE Healthcare). Sekat tapak tidak spesifik dan inkubasi dengan antibodi primer (lihat Jadual S1 untuk butiran) dalam susu 5% dalam TBST (salin penimbal Tris dengan Tween), langkah pencucian dan antibodi sekunder dalam Inkubasi TBST. Inkubasi dengan antibodi primer semalaman pada suhu +4°C. Selepas pencucian, sapukan antibodi sekunder selama 2 jam pada suhu bilik. Seterusnya, dengan mengeram tompokan yang sama dengan antibodi anti-β-aktin, pemuatan yang sama telah disahkan. Pengesanan dengan menukar kepada kemiluminesen dan meningkatkan kemiluminesen (GE Healthcare).
Neuron yang sebelum ini ditanam pada penutup kaca telah difiksasi dengan 4% paraformaldehid (PFA)/PBS pada titik masa yang ditentukan pada suhu bilik selama 10 minit. Penutup pertama kali diresap dengan 0.1% Triton X-100/PBS selama 5 minit pada suhu bilik, dan kemudian dalam penimbal penyekat [3% albumin serum lembu (BSA)/PBS]. Pada hari kedua, penutup dibasuh dengan penimbal penyekat dan diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi fluorofor yang sesuai selama 2 jam pada suhu bilik; akhirnya, sampel dibasuh dengan teliti dalam PBS dengan 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) yang diwarnakan balas dan kemudian difiksasi pada slaid mikroskop dengan Aqua-Poly/Mount.
Tikus (jantan dan betina) telah dibius melalui suntikan intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) dan xylazine (10 mg/kg) dan diberikan secara subkutaneus dengan analgesik karprofen (5 mg/kg). Kemudian, letakkannya dalam instrumen stereotaktik (Kopf) yang dilengkapi dengan pad suam. Dedahkan tengkorak dan gunakan gerudi gigi untuk menipiskan bahagian korteks serebelum yang sepadan dengan tulang mis (dari lambda: ekor 1.8, lateral 1, sepadan dengan lobul IV dan V). Gunakan jarum picagari melengkung untuk membuat lubang kecil pada tengkorak dengan berhati-hati bagi mengelakkan gangguan vaskular di bawah. Kemudian, kapilari kaca nipis yang dilukis dimasukkan perlahan-lahan ke dalam lubang mikro (dari -1.3 hingga -1 di bahagian ventral dura mater), dan 200 hingga 300 nl AAV disuntik ke dalam penyuntik mikro (Narishige) dengan picagari manual (Narishige) beberapa kali pada tekanan rendah dalam tempoh masa 10 hingga 20 minit. Selepas infusi, letakkan kapilari selama 10 minit lagi untuk membolehkan virus merebak sepenuhnya. Selepas kapilari ditarik balik, kulit dijahit dengan teliti untuk meminimumkan keradangan luka dan membolehkan haiwan itu pulih. Haiwan-haiwan tersebut dirawat dengan analgesik (caspofen) selama beberapa hari selepas pembedahan, di mana keadaan fizikal mereka dipantau dengan teliti dan kemudian mereka dimatikan pada masa yang dinyatakan. Semua prosedur telah dijalankan mengikut garis panduan Eropah, kebangsaan dan institusi dan telah diluluskan oleh LandesamtfürNatur dari Umwelt dan Verbraucherschutz, Rhine Utara-Westphalia, Jerman.
Haiwan-haiwan tersebut dibius dengan ketamin (100 mg/kg) dan xylazine (10 mg/kg), dan jantung diperfusikan dengan 0.1 M PBS terlebih dahulu, dan kemudian dengan 4% PFA dalam PBS. Tisu dibedah dan difiksasi dalam 4% PFA/PBS semalaman pada suhu 4°C. Pisau bergetar (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) digunakan untuk menyediakan bahagian sagital (tebal 50 μm) daripada otak yang difiksasi dalam PBS. Melainkan dinyatakan sebaliknya, pewarnaan bahagian terapung bebas dilakukan seperti yang diterangkan di atas (13) pada suhu bilik dan dikacau. Pendek kata, pertama, hirisan yang diperoleh dipermeabilisasikan dengan 0.5% Triton X-100/PBS selama 15 minit pada suhu bilik; untuk beberapa epitop (Pcx dan Shmt2), dengan memasukkan penimbal tris-EDTA pada 80°C (PH 9) panaskan hirisan selama 25 minit dan bukannya langkah ini. Seterusnya, bahagian-bahagian tersebut diinkubasi dengan antibodi primer (lihat Jadual S1) dalam penimbal penyekat (3% BSA/PBS) pada suhu 4°C semalaman sambil dikacau. Keesokan harinya, bahagian-bahagian tersebut dibasuh dengan penimbal penyekat dan diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi fluorofor yang sesuai selama 2 jam pada suhu bilik; akhirnya, bahagian-bahagian tersebut dibasuh dengan teliti dalam PBS, diwarnakan balas dengan DAPI, dan kemudian difiksasi dengan AquaPolymount Pada slaid mikroskop.
Mikroskop confocal pengimbasan laser (TCS SP8-X atau TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) yang dilengkapi dengan laser cahaya putih dan laser ultraungu diod 405 telah digunakan untuk mengimej sampel. Dengan mengujakan fluorofor dan mengumpul isyarat dengan Pengesan Hibrid (HyDs), perisian LAS-X telah digunakan untuk mengumpul imej bertindan yang mematuhi pensampelan Nyquist dalam mod berjujukan: untuk panel bukan kuantitatif, ia adalah isyarat yang sangat dinamik (contohnya, dalam sel somatik dan dendrit) mtYFP) Gunakan HyD untuk mengesan bilangan PN dalam mod BrightR). Gating dari 0.3 hingga 6 ns digunakan untuk mengurangkan latar belakang.
Pengimejan masa nyata sel yang telah disusun. Selepas disusun dalam medium Neurobasal-A yang mengandungi suplemen B27 1% dan 0.5 mM GlutaMax, sel-sel telah segera ditanam pada slaid kaca bersalut poli-l-lisin (μ-Slide8 Well, Ibidi, nombor katalog 80826), dan kemudian simpan pada suhu 37°C dan 5% CO2 selama 1 jam untuk membolehkan sel-sel mendap. Pengimejan masa nyata telah dilakukan pada mikroskop confocal pengimbasan laser Leica SP8 yang dilengkapi dengan laser putih, HyD, kanta objektif minyak 63×[1.4 apertur berangka (NA)] dan peringkat pemanasan.
Tikus itu dibius dengan cepat dengan karbon dioksida dan dipenggal kepalanya, otaknya segera dikeluarkan dari tengkorak, dan dipotong menjadi bahagian sagital setebal 200μm (untuk eksperimen pelabelan 13C) atau setebal 275μm (untuk dua eksperimen foton) yang diisi dengan bahan berikut. Aiskrim (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) diisi dengan bahan berikut: 125 mM cecair serebrospinal tiruan (ACSF) rendah Ca2 + sejuk ais, tepu karbon (95% O2 dan 5% CO2) NaCl, 2.5 mM KCl, penimbal natrium fosfat 1.25 mM, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukosa, 0.5 mM CaCl2 dan 3.5 mM MgCl2 (tekanan osmotik 310 hingga 330 mmol). Pindahkan hirisan otak yang diperoleh ke ruang pra-inkubasi yang mengandungi Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM penimbal natrium fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 dan 2.0 mM MgCl2) Sederhana) pH 7.4 dan 310 hingga 320 mmol).
Semasa proses pengimejan, hirisan telah dipindahkan ke bilik pengimejan khusus, dan eksperimen telah dijalankan di bawah perfusi ACSF berterusan pada suhu malar 32° hingga 33°C. Mikroskop pengimbasan laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) yang dilengkapi dengan kanta objektif Leica 25x (NA 0.95, air), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) telah digunakan untuk pengimejan hirisan. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Perubahan dalam keadaan redoks sitoplasma PN diukur oleh FLIM dua foton dalam hirisan otak sagital, di mana biosensor Grx1-roGFP2 menyasarkan PN. Dalam lapisan PN, medan pemerolehan dipilih kira-kira 50 hingga 80 μm di bawah permukaan hirisan untuk memastikan terdapat PN yang berdaya maju (iaitu, kekurangan struktur manik atau perubahan morfologi neuron di sepanjang dendrit) dan sensor roGFP2 berganda positif dan AAV yang mengekod shRNA PCx atau jujukan kawalannya (setiap satu mengekspresikan bersama mCherry). Kumpul imej tindanan tunggal dengan zum digital 2x [panjang gelombang pengujaan: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Pengesanan: kumpulan penapis HyD dalaman, fluorescein isothiocyanate (FITC)] dan purata imej dalam masa 2 hingga 3 minit digunakan untuk memastikan foton yang mencukupi dikumpul (1000 foton secara keseluruhan) untuk pemadanan lengkung. Kepekaan prob Grx1-roGFP2 dan pengesahan keadaan FLIM telah dilakukan dengan memantau nilai jangka hayat roGFP2 apabila menambah 10 mM H2O2 eksogen kepada perfusi ACSF (untuk memaksimumkan pengoksidaan, mengakibatkan peningkatan jangka hayat), dan kemudian menambah 2 mM ditiotreitol (meminimumkan tahap pengurangan, mengakibatkan penurunan jangka hayat) (Rajah S8, D hingga G). Gunakan perisian FLIMfit 5.1.1 untuk menganalisis keputusan yang diperolehi, padankan lengkung pereputan eksponen tunggal keseluruhan imej kepada IRF yang diukur (fungsi tindak balas instrumen), dan χ2 adalah lebih kurang 1. Untuk mengira jangka hayat PN tunggal, topeng di sekeliling badan saraf dilukis secara manual, dan purata jangka hayat dalam setiap topeng digunakan untuk kuantifikasi.
Analisis potensi mitokondria. Selepas keratan akut diinkubasi dengan 100 nM TMRM yang ditambah terus kepada ACSF yang telah diperfusi selama 30 minit, perubahan potensi mitokondria PN diukur dengan mikroskop dua foton. Pengimejan TMRM dilakukan dengan mengujakan prob pada 920 nm dan menggunakan HyD dalaman (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) untuk mengumpul isyarat; dengan menggunakan panjang gelombang pengujaan yang sama tetapi menggunakan HyD dalaman yang berbeza (FITC: 525/50) untuk imej mtYFP. Gunakan pemalam Kalkulator Imej ImageJ untuk menilai potensi mitokondria pada peringkat sel tunggal. Pendek kata, persamaan pemalam: isyarat = min (mtYFP, TMRM) digunakan untuk mengenal pasti kawasan mitokondria yang menunjukkan isyarat TMRM dalam Purkinje Somali dalam imej confocal tindanan tunggal saluran yang sepadan. Kemudian luas piksel dalam topeng yang terhasil diukur, dan kemudian dinormalisasi pada imej tindanan tunggal ambang yang sepadan bagi saluran mtYFP untuk mendapatkan pecahan mitokondria yang menunjukkan potensi mitokondria.
Imej tersebut telah dinyahkonvolusikan dengan perisian Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Bagi gambar jubin yang diimbas, montaj satu jubin dibuat menggunakan algoritma jahitan automatik yang disediakan oleh perisian LAS-X. Selepas penentukuran imej, gunakan ImageJ dan Adobe Photoshop untuk memproses imej selanjutnya dan melaraskan kecerahan dan kontras secara seragam. Gunakan Adobe Illustrator untuk penyediaan grafik.
Analisis fokus mtDNA. Bilangan lesi mtDNA diukur pada bahagian serebelum yang dilabelkan dengan antibodi terhadap DNA melalui mikroskop konfokal. Setiap kawasan sasaran dicipta untuk badan sel dan nukleus setiap sel, dan kawasan masing-masing dikira menggunakan pemalam Multi Measure (perisian ImageJ). Tolak kawasan nuklear daripada kawasan badan sel untuk mendapatkan kawasan sitoplasma. Akhir sekali, pemalam Analyze Particles (perisian ImageJ) digunakan untuk mengukur titik DNA sitoplasma yang menunjukkan mtDNA pada imej ambang secara automatik, dan keputusan yang diperoleh dinormalkan kepada purata PN tikus CTRL. Keputusan dinyatakan sebagai purata bilangan nukleosida setiap sel.
Analisis ekspresi protein. Gunakan pemalam Kalkulator Imej ImageJ untuk menilai ekspresi protein dalam PN pada peringkat sel tunggal. Pendek kata, dalam imej konfigurasi lapisan tunggal saluran yang sepadan, melalui persamaan: isyarat = min (mtYFP, antibodi), kawasan mitokondria yang menunjukkan imunoreaktiviti terhadap antibodi tertentu dalam Purkina dikenal pasti. Kemudian kawasan piksel dalam topeng yang terhasil diukur, dan kemudian dinormalisasi pada imej tindanan tunggal ambang yang sepadan bagi saluran mtYFP untuk mendapatkan pecahan mitokondria protein yang dipaparkan.
Analisis ketumpatan sel Purkinje. Pemalam Cell Counter ImageJ telah digunakan untuk menilai ketumpatan Purkinje dengan membahagikan bilangan sel Purkinje yang dikira dengan panjang cincin serebelum yang diduduki oleh sel yang dikira.
Penyediaan dan pengumpulan sampel. Otak daripada kumpulan kawalan dan tikus Mfn2cKO telah difiksasi dalam 2% PFA/2.5% glutaraldehida dalam 0.1 M penimbal fosfat (PB), dan kemudian keratan koronal telah disediakan menggunakan silia (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Ketebalan 50 hingga 60 μm). Kemudian difiksasi dalam penimbal PB dalam 1% os tetraoksida dan 1.5% kalium ferosianda pada suhu bilik selama 1 jam. Keratan tersebut dibasuh tiga kali dengan air suling, dan kemudian diwarnakan dengan 70% etanol yang mengandungi 1% uranil asetat selama 20 minit. Keratan tersebut kemudiannya dinyahhidratkan dalam alkohol bergred dan dibenamkan dalam resin epoksi Durcupan ACM (resin tuangan Araldite M) (Sains Mikroskopi Elektron, nombor katalog 14040) di antara slaid kaca bersalut silikon, dan akhirnya pada suhu 60°C, dipolimerkan dalam ketuhar selama 48 jam. Kawasan korteks serebelum telah dipilih dan keratan ultra nipis 50 nm dipotong pada Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) dan dipilih pada grid celah kuprum 2×1 mm yang disalut dengan filem polistirena. Keratan tersebut diwarnakan dengan larutan uranil asetat 4% dalam H2O selama 10 minit, dibasuh dengan H2O beberapa kali, kemudian dengan sitrat plumbum Reynolds dalam H2O selama 10 minit, dan kemudian dibasuh dengan H2O beberapa kali. Mikrograf diambil dengan mikroskop elektron penghantaran Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) menggunakan kamera digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Jerman).
Bagi tikus yang dijangkiti AAV, otak dipisahkan dan dihiris menjadi bahagian sagital setebal 1 mm, dan serebelum diperiksa menggunakan mikroskop pendarfluor untuk mengenal pasti cincin yang dijangkiti AAV (iaitu, pengekspresian mCherry). Hanya eksperimen di mana suntikan AAV menghasilkan kecekapan transduksi yang sangat tinggi pada lapisan sel Purkinje (iaitu hampir keseluruhan lapisan) dalam sekurang-kurangnya dua cincin serebelum berturut-turut digunakan. Gelung transduksi AAV dibedah mikro untuk pasca-fiksasi semalaman (4% PFA dan 2.5% glutaraldehida dalam penimbal kokoat 0.1 M) dan diproses selanjutnya. Untuk pembenaman EPON, tisu yang difiksasi dibasuh dengan penimbal natrium kokoat 0.1 M (Applichem), dan diinkubasi dengan 2% OsO4 (os, Perkhidmatan Sains; Caco) dalam penimbal natrium kokoat 0.1 M (Applichem) selama 4 jam, kemudian dibasuh selama 2 jam. Ulangi 3 kali dengan penimbal kokamida 0.1 M. Seterusnya, siri menaik etanol digunakan untuk mengeram setiap larutan etanol pada suhu 4°C selama 15 minit untuk mengeringkan tisu. Tisu dipindahkan ke propilena oksida dan diinkubasi semalaman dalam EPON (Sigma-Aldrich) pada suhu 4°C. Letakkan tisu dalam EPON segar pada suhu bilik selama 2 jam, dan kemudian benamkannya pada suhu 62°C selama 72 jam. Gunakan ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) dan pisau berlian (Diatome, Biel, Switzerland) untuk memotong bahagian ultra nipis 70 nm, dan warnakan dengan uranil asetat 1.5% selama 15 minit pada suhu 37°C, dan warnakan dengan larutan plumbum sitrat selama 4 minit. Mikrograf elektron diambil menggunakan mikroskop elektron penghantaran JEM-2100 Plus (JEOL) yang dilengkapi dengan perisian Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) dan DigitalMicrograph (Gatan). Untuk analisis, mikrograf elektron diperoleh dengan zum digital 5000× atau 10,000×.
Analisis morfologi mitokondria. Bagi semua analisis, kontur mitokondria individu digariskan secara manual dalam imej digital menggunakan perisian ImageJ. Parameter morfologi yang berbeza dianalisis. Ketumpatan mitokondria dinyatakan sebagai peratusan yang diperoleh dengan membahagikan jumlah luas mitokondria setiap sel dengan luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel-luas nukleus sel) × 100. Kebulatan mitokondria dikira dengan formula [4π∙(luas/perimeter 2)]. Morfologi ista mitokondria dianalisis dan dibahagikan kepada dua kategori (“tiub” dan “lepuh”) mengikut bentuk utamanya.
Analisis bilangan dan ketumpatan autofagosom/lisosom. Gunakan perisian ImageJ untuk menggariskan kontur setiap autofagosom/lisosom secara manual dalam imej digital. Kawasan autofagosom/lisosom dinyatakan sebagai peratusan yang dikira dengan membahagikan jumlah luas struktur autofagosom/lisosom setiap sel dengan luas sitoplasma (kawasan sitoplasma=luas sel-luas nukleus)×100. Ketumpatan autofagosom/lisosom dikira dengan membahagikan jumlah keseluruhan dengan bilangan struktur autofagosom/lisosom setiap sel (dari segi luas sitoplasma) (kawasan sitoplasma = luas sel-luas nuklear).
Pelabelan untuk pemotongan akut dan penyediaan sampel. Bagi eksperimen yang memerlukan pelabelan glukosa, pindahkan hirisan otak akut ke ruang pra-inkubasi, yang mengandungi karbon tepu (95% O2 dan 5% CO2), Ca2 + ACSF yang tinggi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM penimbal natrium fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 dan 2.0 mM MgCl2, diselaraskan kepada pH 7.4 dan 310 hingga 320 mOsm), di mana glukosa ialah 13C6- Penggantian glukosa (Eurisotop, nombor katalog CLM-1396). Bagi eksperimen yang memerlukan pelabelan piruvat, pindahkan hirisan otak akut ke Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM penimbal natrium fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 dan Tambah 2.0 mM MgCl2, laraskan kepada pH 7.4 dan 310 kepada 320 mOsm), dan tambah 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, nombor katalog CLM-1082). Inkubasi keratan selama 90 minit pada suhu 37°C. Pada akhir eksperimen, keratan dibasuh dengan cepat dengan larutan akueus (pH 7.4) yang mengandungi 75 mM ammonium karbonat, dan kemudian dihomogenkan dalam 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: air. Selepas keratan diinkubasi di atas ais selama 30 minit, sampel disentrifugasi pada 21,000 g selama 10 minit pada suhu 4°C, dan supernatan jernih dikeringkan dalam penumpu SpeedVac. Pelet metabolit kering yang terhasil disimpan pada suhu -80°C sehingga analisis.
Analisis kromatografi cecair-spektrometri jisim bagi 13 asid amino berlabel C. Untuk analisis kromatografi cecair-spektrometri jisim (LC-MS), pelet metabolit telah digantung semula dalam 75μl air gred LC-MS (Honeywell). Selepas sentrifugasi pada 21,000 g selama 5 minit pada suhu 4°C, 20 μl supernatan yang telah dijernihkan telah digunakan untuk analisis fluks asid amino, manakala baki ekstrak telah digunakan serta-merta untuk analisis anion (lihat di bawah). Analisis asid amino telah dilakukan menggunakan protokol derivatisasi benzoil klorida yang diterangkan sebelum ini (55, 56). Dalam langkah pertama, 10μl 100 mM natrium karbonat (Sigma-Aldrich) telah ditambah kepada 20μl ekstrak metabolit, dan kemudian 10μl 2% benzoil klorida (Sigma-Aldrich) telah ditambah kepada ACN gred LC. Sampel divorteks sebentar dan kemudian disentrifugasi pada 21,000 g selama 5 minit pada suhu 20°C. Pindahkan supernatan yang telah dibersihkan ke dalam vial autosampler 2 ml dengan sisipan kaca kon (isipadu 200 μl). Sampel dianalisis menggunakan sistem LC prestasi ultra tinggi Acquity iClass (Waters) yang disambungkan kepada spektrometer jisim ketepatan resolusi tinggi Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Untuk analisis, 2μl sampel terbitan disuntik ke dalam lajur silika T3 kekuatan tinggi 100×1.0 mm (Waters) yang mengandungi zarah 1.8μm. Kadar aliran ialah 100μl/min, dan sistem penimbal terdiri daripada penimbal A (10 mM ammonium format dan 0.15% asid formik dalam air) dan penimbal B (ACN). Kecerunan adalah seperti berikut: 0%B pada 0 minit; 0%B. 0 hingga 15% B pada 0 hingga 0.1 minit; 15 hingga 17% B pada 0.1 hingga 0.5 minit; B pada 17 hingga 55% pada 0.5 hingga 14 minit; B pada 55 hingga 70% pada 14 hingga 14.5 minit; pada 14.5 hingga 70 hingga 100% B pada 18 minit; 100% B pada 18 hingga 19 minit; 100 hingga 0% B pada 19 hingga 19.1 minit; 0% B pada 19.1 hingga 28 minit (55, 56). Spektrometer jisim QE-HF beroperasi dalam mod pengionan positif dengan julat jisim m/z (nisbah jisim/cas) 50 hingga 750. Resolusi yang digunakan ialah 60,000, dan sasaran ion kawalan gandaan (AGC) yang diperoleh ialah 3×106, dan masa ion maksimum ialah 100 milisaat. Sumber pengionan elektrosemburan (ESI) yang dipanaskan beroperasi pada voltan semburan 3.5 kV, suhu kapilari 250°C, aliran udara sarung 60 AU (unit sewenang-wenangnya), dan aliran udara tambahan 20 AU. 250°C. Kanta S ditetapkan kepada 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS bagi asid organik berlabel 13C. Baki mendakan metabolit (55μl) dianalisis menggunakan sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) yang disambungkan kepada spektrometer jisim QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Pendek kata, 5μl ekstrak metabolit disuntik ke dalam lajur Dionex IonPac AS11-HC yang dilengkapi dengan HPLC (2 mm×250 mm, saiz zarah 4μm, Thermo Fisher Scientific) dalam mod gelung separa tolak masuk dengan nisbah pengisian 1. ) Lajur pengawal Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Suhu lajur dikekalkan pada 30°C, dan autosampler ditetapkan kepada 6°C. Gunakan kartrij kalium hidroksida yang disediakan dengan air ternyahion untuk menghasilkan kecerunan kalium hidroksida melalui penjana eluen. Pengasingan metabolit pada kadar aliran 380μl/min, dengan menggunakan kecerunan berikut: 0 hingga 3 minit, 10 mM KOH; 3 hingga 12 minit, 10 hingga 50 mM KOH; 12 hingga 19 minit, 50 hingga 100 mM KOH; 19 hingga 21 minit, 100 mM KOH; 21 hingga 21.5 minit, 100 hingga 10 mM KOH. Lajur telah diseimbangkan semula di bawah 10 mM KOH selama 8.5 minit.
Metabolit yang dielusi digabungkan dengan aliran tambahan isopropanol 150μl/min selepas turus dan kemudian diarahkan ke spektrometer jisim resolusi tinggi yang beroperasi dalam mod pengionan negatif. MS memantau julat jisim dari m/z 50 hingga 750 dengan resolusi 60,000. AGC ditetapkan kepada 1×106, dan masa ion maksimum dikekalkan pada 100 ms. Sumber ESI yang dipanaskan dikendalikan pada voltan semburan 3.5 kV. Tetapan lain sumber ion adalah seperti berikut: suhu kapilari 275°C; aliran gas sarung, 60 AU; aliran gas tambahan, 20 AU pada 300°C, dan tetapan kanta S kepada 60 AU.
Analisis data metabolit berlabel 13C. Gunakan perisian TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific) untuk analisis data nisbah isotop. Identiti setiap sebatian telah disahkan oleh sebatian rujukan yang boleh dipercayai dan dianalisis secara bebas. Untuk melaksanakan analisis pengayaan isotop, luas kromatogram ion yang diekstrak (XIC) bagi setiap isotop 13C (Mn) telah diekstrak daripada [M + H]+, di mana n ialah nombor karbon sebatian sasaran, yang digunakan untuk menganalisis asid amino atau [MH]+ digunakan untuk menganalisis anion. Ketepatan jisim XIC adalah kurang daripada lima bahagian per juta, dan ketepatan RT ialah 0.05 minit. Analisis pengayaan dilakukan dengan mengira nisbah setiap isotop yang dikesan kepada jumlah semua isotop sebatian yang sepadan. Nisbah ini diberikan sebagai nilai peratusan bagi setiap isotop, dan hasilnya dinyatakan sebagai pengayaan peratus molar (MPE), seperti yang diterangkan sebelum ini (42).
Pelet neuron beku telah dihomogenkan dalam metanol 80% (v/v) yang sejuk, divorteks, dan diinkubasi pada -20°C selama 30 minit. Vorteks sampel sekali lagi dan kacau pada +4°C selama 30 minit. Sampel telah disentrifugasi pada 21,000 g selama 5 minit pada suhu 4°C, dan kemudian supernatan yang terhasil dikumpulkan dan dikeringkan menggunakan penumpu SpeedVac pada suhu 25°C untuk analisis seterusnya. Seperti yang diterangkan di atas, analisis LC-MS telah dilakukan pada asid amino sel yang telah disusun. Menggunakan TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific), analisis data telah dilakukan menggunakan jisim monoisotop setiap sebatian. Penormalan kuantitatif data metabolit telah dilakukan menggunakan pakej perisian preprocessCore (57).
Penyediaan hirisan. Tikus dibius dengan cepat dengan karbon dioksida dan dipenggal kepalanya, otaknya segera dikeluarkan dari tengkorak, dan pisau bergetar berisi ais (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) digunakan untuk memotongnya menjadi keratan sagital 300 hingga 375 μm. Penggasan karbon sejuk (95% O2 dan 5% CO2) Ca2 + ACSF rendah (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM penimbal natrium fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 dan 6.0 mM MgCl2. Laraskan kepada pH 7.4 dan 310 hingga 330 mOsm). Pindahkan hirisan otak yang diperoleh ke ruang yang mengandungi Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM penimbal natrium fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 4.0 mM CaCl2 dan mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 dan 310 hingga 320 mOsm). Simpan hirisan selama 20 hingga 30 minit supaya ia boleh dipulihkan sebelum direkodkan.
rakaman. Sebuah pentas mikroskop yang dilengkapi dengan ruang rakaman tetap dan kanta objektif rendaman air 20x (Scientifica) telah digunakan untuk semua rakaman. Sel Purkinje yang diandaikan telah dikenal pasti melalui (i) saiz badan, (ii) lokasi anatomi serebelum, dan (iii) ekspresi gen reporter mtYFP pendarfluor. Pipet tampalan dengan rintangan hujung 5 hingga 11 megohm ditarik keluar oleh kapilari kaca borosilikat (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Jerman) dan pipet mendatar Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Semua rakaman telah dilakukan oleh penguat pengapit tampalan npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Jerman), yang dikawal oleh perisian Signal (versi 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Eksperimen telah direkodkan pada kadar persampelan 12.5 kHz. Isyarat ditapis dengan dua penapis Bessel laluan pintas dengan frekuensi pemotongan masing-masing 1.3 dan 10 kHz. Kapasitans membran dan pipet dikompensasikan oleh litar pampasan menggunakan penguat. Semua eksperimen dijalankan di bawah kawalan kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), yang dikawal oleh perisian Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi dan analisis keseluruhan sel rutin. Sejurus sebelum merekod, isi pipet dengan larutan dalaman yang mengandungi bahan berikut: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM kalium glukonat, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosina trifosfat (GTP) (Na) dan 10.0 mM kreatinin fosfat telah diselaraskan kepada pH 7.25, dan tekanan osmotik ialah 290 mOsm (sukrosa). Sejurus selepas mengenakan daya 0 pA untuk memecahkan membran, potensi membran rehat diukur. Rintangan input diukur dengan mengenakan arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, dan -10 pA. Ukur magnitud tindak balas voltan dan gunakan hukum Ohm untuk mengira rintangan input. Aktiviti spontan telah direkodkan dalam pengapit voltan selama 5 minit, dan sPSC telah dikenal pasti dan diukur dalam Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) menggunakan skrip pengecaman separa automatik. Lengkung IV dan arus keadaan mantap diukur dengan mengapit bateri pada potensi yang berbeza (bermula dari -110 mV) dan meningkatkan voltan dalam langkah 5 mV. Penghasilan AP telah diuji dengan menggunakan arus penyahkutuban. Apit sel pada -70 mV sambil menggunakan denyut arus penyahkutuban. Laraskan saiz langkah setiap unit rakaman secara berasingan (10 hingga 60 pA). Kira frekuensi AP maksimum dengan mengira secara manual lonjakan denyut yang menyebabkan frekuensi AP tertinggi. Ambang AP dianalisis dengan menggunakan terbitan kedua denyut penyahkutuban yang pertama kali mencetuskan satu atau lebih AP.
Konfigurasi dan analisis tampalan berlubang. Lakukan rakaman tampalan berlubang menggunakan protokol standard. Gunakan pipet bebas ATP dan GTP yang tidak mengandungi bahan-bahan berikut: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA dan 2 mM MgCl2, dan laraskan kepada pH 7.2 (menggunakan KOH). ATP dan GTP diabaikan daripada larutan intraselular untuk mengelakkan kebolehtelapan membran sel yang tidak terkawal. Pipet tampalan diisi dengan larutan dalaman yang mengandungi amfoterisin (kira-kira 200 hingga 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) untuk mendapatkan rekod tampalan berlubang. Amfoterisin dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (kepekatan akhir: 0.1 hingga 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Kepekatan DMSO yang digunakan tidak mempunyai kesan yang ketara pada neuron yang dikaji. Semasa proses penebuk, rintangan saluran (Ra) dipantau secara berterusan, dan eksperimen dimulakan selepas amplitud Ra dan AP stabil (20-40 minit). Aktiviti spontan diukur dalam pengapit voltan dan/atau arus selama 2 hingga 5 minit. Analisis data dilakukan menggunakan Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) dan GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Untuk mengenal pasti AP spontan, pemalam NeuroMatic v3.0c IgorPro digunakan. Kenal pasti AP secara automatik menggunakan ambang yang diberikan, yang dilaraskan secara individu untuk setiap rekod. Menggunakan selang lonjakan, tentukan frekuensi lonjakan dengan frekuensi lonjakan serta-merta maksimum dan frekuensi lonjakan purata.
Pengasingan PN. Dengan menyesuaikan diri dengan protokol yang diterbitkan sebelum ini, PN telah ditulenkan daripada serebelum tikus pada peringkat tertentu (58). Pendek kata, serebelum dibedah dan dicincang dalam medium penceraian sejuk [tanpa HBSS Ca2+ dan Mg2+, ditambah dengan 20 mM glukosa, penisilin (50 U/ml) dan streptomisin (0.05 mg/ml)], dan kemudian mencerna medium tersebut dalam papain [HBSS, ditambah dengan 1-sistein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) dan deoksiribonuklease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Rawat selama 30 minit pada suhu 30°C. Pertama sekali, basuh tisu dalam medium HBSS yang mengandungi lendir telur (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) dan DNase (0.1 mg/ml) pada suhu bilik untuk mencegah pencernaan enzimatik, dan kemudian dalam medium HBSS yang mengandungi 20 mM glukosa. Kisar perlahan-lahan dalam HBSS, penisilin (50 U/ml), streptomisin (0.05 mg/ml) dan DNase (0.1 mg/ml) melepaskan sel tunggal. Suspensi sel yang terhasil ditapis melalui penapis sel 70μm, kemudian sel-sel dipecahkan melalui sentrifugasi (1110 rpm, 5 minit, 4°C) dan digantung semula dalam medium pengasingan [HBSS, ditambah dengan 20 mM glukosa, 20% janin lembu) Serum, penisilin (50 U/ml) dan streptomisin (0.05 mg/ml)]; nilai daya tahan sel dengan propidium iodida dan laraskan ketumpatan sel kepada 1×106 hingga 2×106 sel/ml. Sebelum sitometri aliran, suspensi ditapis melalui penapis sel 50 μm.
Sitometer aliran. Pengisihan sel telah dilakukan pada suhu 4°C menggunakan mesin FACSAria III (BD Biosciences) dan perisian FACSDiva (BD Biosciences, versi 8.0.1). Suspensi sel telah diisih menggunakan muncung 100 μm di bawah tekanan 20 psi pada kadar ~2800 peristiwa/saat. Memandangkan kriteria gating tradisional (saiz sel, diskriminasi bimodal dan ciri-ciri penyebaran) tidak dapat memastikan pengasingan PN yang betul daripada jenis sel lain, strategi gating ditetapkan berdasarkan perbandingan langsung keamatan YFP dan autofluoresen dalam mitoYFP+ ​​dan kawalan mitoYFP − Tikus. YFP diujakan dengan menyinari sampel dengan garis laser 488 nm dan isyarat dikesan menggunakan penapis jalur lulus 530/30 nm. Dalam tikus mitoYFP+, kekuatan relatif gen reporter Rosa26-mitoYFP juga digunakan untuk membezakan serpihan badan neuron dan akson. 7-AAD diujakan dengan laser kuning 561 nm dan dikesan dengan penapis jalur laluan 675/20 nm untuk mengecualikan sel mati. Untuk mengasingkan astrosit pada masa yang sama, ampaian sel diwarnakan dengan ACSA-2-APC, kemudian sampel disinari dengan garis laser 640 nm, dan penapis jalur laluan 660/20 nm digunakan untuk mengesan isyarat.
Sel-sel yang dikumpul telah dipel melalui sentrifugasi (1110 rpm, 5 minit, 4°C) dan disimpan pada suhu -80°C sehingga digunakan. Tikus Mfn2cKO dan anak-anak tikus mereka dikelaskan pada hari yang sama untuk meminimumkan kebolehubahan prosedur. Pembentangan dan analisis data FACS telah dilakukan menggunakan perisian FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Seperti yang dinyatakan di atas (59), PCR masa nyata digunakan untuk mengasingkan DNA daripada neuron yang telah disusun untuk kuantifikasi mtDNA berikutnya. Kelinearan dan kepekaan ambang pada mulanya diuji dengan menjalankan qPCR pada bilangan sel yang berbeza. Pendek kata, kumpulkan 300 PN dalam penimbal lisis yang terdiri daripada 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 dan proteinase K (200 ng/ml) dan inkubasi pada suhu 55°C selama 120 minit. Sel-sel tersebut selanjutnya diinkubasi pada suhu 95°C selama 10 minit untuk memastikan penyahaktifan lengkap proteinase K. Menggunakan prob TaqMan (Thermo Fisher) khusus untuk mt-Nd1, mtDNA diukur dengan PCR separa kuantitatif dalam sistem PCR Masa Nyata 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Sains, nombor katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nombor katalog AIVI3E8) dan gen 18S (Thermo Fisher Scientific, nombor katalog Hs99999901_s1).
Penyediaan sampel proteom. Dengan memanaskan larutan pada suhu 95°C selama 10 minit dan menyonikasikan, dalam penimbal lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfina hidroklorida, 10 mM kloroasetamida dan 100 mM pelet neuron beku tris-Lise dalam HCl]. Pada Bioruptor (Diagenode) selama 10 minit (denyut 30 saat / tempoh jeda 30 saat). Sampel dicairkan 1:10 dalam 20 mM tris-HCl (pH 8.0), dicampurkan dengan 300 ng tripsin emas (Promega), dan diinkubasi semalaman pada suhu 37°C untuk mencapai pencernaan yang lengkap. Pada hari kedua, sampel disentrifugasi pada 20,000 g selama 20 minit. Supernatan dicairkan dengan 0.1% asid formik, dan larutan dinyahgaram dengan StageTips buatan sendiri. Sampel dikeringkan dalam instrumen SpeedVac (pemekat Eppendorf ditambah 5305) pada suhu 45°C, dan kemudian peptida digantung dalam 0.1% asid formik. Semua sampel disediakan secara serentak oleh orang yang sama. Untuk menganalisis sampel astrosit, 4 μg peptida yang dinyahgaram dilabelkan dengan tag jisim tandem (TMT10plex, nombor katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) dengan nisbah reagen peptida kepada TMT sebanyak 1:20. Untuk pelabelan TMT, 0.8 mg reagen TMT digantung semula dalam 70 μl ACN anhidrus, dan peptida kering dibentuk semula menjadi 9 μl 0.1 M TEAB (trietilamonium bikarbonat), yang mana 7 μl reagen TMT dalam ACN ditambah. Kepekatannya ialah 43.75%. Selepas 60 minit pengeraman, tindak balas dipadamkan dengan 2 μl 5% hidroksilamin. Peptida berlabel dikumpulkan, dikeringkan, digantung semula dalam 200μl asid formik (FA) 0.1%, dibahagikan kepada dua, dan kemudian dinyahgaram menggunakan StageTips buatan sendiri. Menggunakan kromatografi cecair prestasi ultra tinggi UltiMate 3000 (kromatografi cecair prestasi ultra tinggi UltiMate 3000), salah satu daripada dua bahagian dipecahkan pada lajur kromatografi Acquity 1mm x 150mm yang diisi dengan zarah C18 130Å1.7μm (Waters, No. katalog SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Asingkan peptida pada kadar aliran 30μl/min, asingkan daripada penimbal 1% hingga 50% B selama 85 minit dengan kecerunan langkah demi langkah 96 minit, daripada penimbal 50% hingga 95% B selama 3 minit, kemudian 8 minit untuk Penimbal 95% B; Penimbal A ialah 5% ACN dan 10 mM ammonium bikarbonat (ABC), dan penimbal B ialah 80% ACN dan 10 mM ABC. Kumpulkan pecahan setiap 3 minit dan gabungkannya kepada dua kumpulan (1 + 17, 2 + 18, dsb.) dan keringkannya dalam emparan vakum.
Analisis LC-MS/MS. Untuk spektrometri jisim, peptida (nombor r119.aq) telah diasingkan pada lajur analitik PicoFrit berdiameter dalam 25 cm, 75 μm (kanta objektif baharu, nombor bahagian PF7508250) yang dilengkapi dengan medium ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9 μm (Dr. Maisch, mat), Gunakan EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Jerman). Lajur dikekalkan pada suhu 50°C. Penimbal A dan B masing-masing terdiri daripada 0.1% asid formik dalam air dan 0.1% asid formik dalam 80% ACN. Peptida diasingkan daripada 6% hingga 31% penimbal B selama 65 minit dan daripada 31% hingga 50% penimbal B selama 5 minit dengan kecerunan 200 nl/min. Peptida yang dielusi telah dianalisis pada spektrometer jisim Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Pengukuran m/z prekursor peptida dilakukan dengan resolusi 120,000 dalam julat 350 hingga 1500 m/z. Menggunakan tenaga perlanggaran ternormalisasi 27%, prekursor terkuat dengan keadaan cas 2 hingga 6 dipilih untuk pembelahan penceraian perangkap C (HCD) bertenaga tinggi. Masa kitaran ditetapkan kepada 1 s. Nilai m/z serpihan peptida diukur dalam perangkap ion menggunakan sasaran AGC terkecil iaitu 5×104 dan masa suntikan maksimum 86 ms. Selepas pemecahan, prekursor diletakkan pada senarai pengecualian dinamik selama 45 s. Peptida berlabel TMT telah diasingkan pada lajur Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nombor katalog 164942), dan spektrum migrasi telah dianalisis pada spektrometer jisim Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) yang dilengkapi dengan peralatan ion bentuk gelombang asimetri medan tinggi (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) yang beroperasi pada dua voltan pampasan iaitu −50 dan −70 V. MS3 yang dipilih berdasarkan prekursor penyegerakan digunakan untuk pengukuran isyarat ion laporan TMT. Pemisahan peptida telah dijalankan pada EASY-nLC 1200, menggunakan elusi kecerunan linear 90%, dengan kepekatan penimbal 6% hingga 31%; penimbal A ialah 0.1% FA, dan penimbal B ialah 0.1% FA dan 80% ACN. Lajur analitikal dikendalikan pada 50°C. Gunakan FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Scientific) untuk memisahkan fail asal mengikut voltan pampasan FAIMS.
Pengenalpastian dan kuantifikasi protein. Menggunakan enjin carian Andromeda bersepadu, data asal dianalisis menggunakan MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Selain urutan Cre recombinase dan YFP yang diperoleh daripada Aequorea victoria, spektrum serpihan peptida telah dicari untuk urutan kanonik dan urutan isoform bagi proteom rujukan tikus (ID Proteom UP000000589, dimuat turun daripada UniProt pada Mei 2017). Pengoksidaan metionin dan asetilasi N-terminal protein ditetapkan sebagai pengubahsuaian berubah-ubah; metilasi sistein karbamoil ditetapkan sebagai pengubahsuaian tetap. Parameter pencernaan ditetapkan kepada "kekhususan" dan "tripsin/P". Bilangan minimum peptida dan peptida pisau cukur yang digunakan untuk pengenalpastian protein ialah 1; bilangan minimum peptida unik ialah 0. Di bawah syarat pemadanan peta peptida, kadar pengenalpastian protein ialah 0.01. Pilihan "Peptida Kedua" diaktifkan. Gunakan pilihan "padanan antara larian" untuk memindahkan pengenalpastian yang berjaya antara fail asal yang berbeza. Gunakan kiraan nisbah minimum LFQ 1 untuk kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Keamatan LFQ ditapis untuk sekurang-kurangnya dua nilai sah dalam sekurang-kurangnya satu kumpulan genotip pada setiap titik masa, dan diekstrapolasi daripada taburan normal dengan lebar .0.3 dan bergerak ke bawah 1.8. Gunakan platform pengkomputeran Perseus (https://maxquant.net/perseus/) dan R (https://r-project.org/) untuk menganalisis keputusan LFQ. Ujian t sederhana dua hala daripada pakej perisian limma telah digunakan untuk analisis ekspresi pembezaan (61). Analisis data penerokaan dilakukan menggunakan ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally dan pheatmap. Data proteomik berasaskan TMT dianalisis menggunakan MaxQuant versi 1.6.10.43. Cari data proteomik mentah daripada pangkalan data proteomik manusia UniProt, yang telah dimuat turun pada September 2018. Analisis ini merangkumi faktor pembetulan ketulenan isotop yang disediakan oleh pengilang. Gunakan limma dalam R untuk analisis ekspresi pembezaan. Data asal, hasil carian pangkalan data dan aliran kerja serta keputusan analisis data semuanya disimpan dalam perikatan ProteomeXchange melalui repositori rakan kongsi PRIDE dengan pengecam set data PXD019690.
Anotasi fungsi memperkayakan analisis. Alat Analisis Laluan Ingenuity (QIAGEN) telah digunakan untuk menentukan kekayaan istilah anotasi fungsi bagi set data pada 8 minggu (Rajah 1). Pendek kata, senarai protein kuantitatif yang diperoleh daripada analisis data LC-MS/MS (spektrometri jisim tandem) digunakan dengan kriteria penapis berikut: Mus musculus dipilih sebagai spesies dan latar belakang, dan kategori tersebut menunjukkan nilai P yang diselaraskan oleh Benjamini untuk pengayaan 0.05 atau lebih rendah dianggap signifikan. Untuk graf ini, lima kategori berlebihan teratas dalam setiap kluster berdasarkan nilai P yang diselaraskan ditunjukkan. Menggunakan ujian-t berganda, menggunakan program rangsangan linear dua peringkat Benjamini, Krieger, dan Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein kursus masa dilakukan pada calon penting yang dikenal pasti dalam setiap kategori, dan setiap baris dianalisis secara berasingan. Tidak perlu menerima pakai SD yang konsisten.
Untuk membandingkan hasil kajian ini dengan pangkalan data yang diterbitkan dan menghasilkan gambar rajah Venn dalam Rajah 1, kami menggabungkan senarai protein kuantitatif dengan anotasi MitoCarta 2.0 (24). Gunakan alat dalam talian Lukis Gambar Rajah Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) untuk menghasilkan gambar rajah.
Untuk maklumat terperinci tentang prosedur statistik yang digunakan untuk analisis proteomik, sila rujuk bahagian Bahan dan Kaedah yang sepadan. Untuk semua eksperimen lain, maklumat terperinci boleh didapati dalam legenda yang sepadan. Melainkan dinyatakan sebaliknya, semua data dinyatakan sebagai min ± SEM, dan semua analisis statistik dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism 8.1.2.
Untuk bahan tambahan bagi artikel ini, sila lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ini merupakan artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah terma Lesen Creative Commons Atribusi-Bukan-Komersial, yang membenarkan penggunaan, pengedaran dan penghasilan semula dalam sebarang medium, selagi penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah karya asal adalah betul. Rujukan.
Nota: Kami hanya meminta anda memberikan alamat e-mel anda supaya orang yang anda cadangkan ke halaman tersebut tahu bahawa anda mahu mereka melihat e-mel tersebut dan ia bukan spam. Kami tidak akan merekodkan sebarang alamat e-mel.
Soalan ini digunakan untuk menguji sama ada anda seorang pelawat dan mencegah penyerahan spam automatik.
Oleh E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron disfungsional mendedahkan bahawa program metabolik diaktifkan untuk mengatasi neurodegenerasi.
Oleh E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron disfungsional mendedahkan bahawa program metabolik diaktifkan untuk mengatasi neurodegenerasi.
©2020 Persatuan Amerika untuk Kemajuan Sains. semua hak terpelihara. AAAS ialah rakan kongsi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.