Artikel ini merupakan sebahagian daripada topik penyelidikan “Teknologi bioremediasi lanjutan dan proses kitar semula sebatian organik sintetik (SOC)”. Lihat semua 14 artikel.
Hidrokarbon aromatik polisiklik berat molekul rendah (PAH) seperti naftalena dan naftalena tersubstitusi (metilnaftalena, asid naftoik, 1-naftil-N-metilkarbamat, dll.) digunakan secara meluas dalam pelbagai industri dan bersifat genotoksik, mutagenik dan/atau karsinogenik kepada organisma. Sebatian organik sintetik (SOC) atau xenobiotik ini dianggap sebagai bahan pencemar keutamaan dan menimbulkan ancaman serius kepada alam sekitar global dan kesihatan awam. Keamatan aktiviti manusia (contohnya penggasan arang batu, penapisan minyak, pelepasan kenderaan dan aplikasi pertanian) menentukan kepekatan, nasib dan pengangkutan sebatian yang ada di mana-mana dan berterusan ini. Selain kaedah rawatan/penyingkiran fizikal dan kimia, teknologi hijau dan mesra alam seperti bioremediasi, yang menggunakan mikroorganisma yang mampu menguraikan POC sepenuhnya atau menukarkannya kepada produk sampingan yang tidak toksik, telah muncul sebagai alternatif yang selamat, kos efektif dan menjanjikan. Pelbagai spesies bakteria yang tergolong dalam filum Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia, dan Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus dan Paenibacillus), dan Actinobacteria (Rhodococcus dan Arthrobacter) dalam mikrobiota tanah telah menunjukkan keupayaan untuk menguraikan pelbagai sebatian organik. Kajian metabolik, genomik, dan analisis metagenomik membantu kita memahami kerumitan dan kepelbagaian katabolik yang terdapat dalam bentuk kehidupan mudah ini, yang boleh digunakan selanjutnya untuk biodegradasi yang cekap. Kewujudan PAH dalam jangka masa panjang telah mengakibatkan kemunculan fenotip degradasi baharu melalui pemindahan gen mendatar menggunakan unsur genetik seperti plasmid, transposon, bakteriofaj, pulau genomik, dan unsur konjugatif integratif. Biologi sistem dan kejuruteraan genetik isolat atau komuniti model tertentu (konsortia) boleh membolehkan bioremediasi PAH ini yang komprehensif, pantas dan cekap melalui kesan sinergi. Dalam ulasan ini, kami menumpukan pada laluan dan kepelbagaian metabolik yang berbeza, komposisi dan kepelbagaian genetik, dan tindak balas/penyesuaian selular naftalena dan bakteria pengurai naftalena yang digantikan. Ini akan memberikan maklumat ekologi untuk aplikasi lapangan dan pengoptimuman strain untuk bioremediasi yang cekap.
Perkembangan pesat industri (petrokimia, pertanian, farmaseutikal, pewarna tekstil, kosmetik, dll.) telah menyumbang kepada kemakmuran ekonomi global dan peningkatan taraf hidup. Perkembangan eksponen ini telah menghasilkan sejumlah besar sebatian organik sintetik (SOC), yang digunakan untuk mengeluarkan pelbagai produk. Sebatian asing atau SOC ini termasuk hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH), racun perosak, racun herba, pemplastik, pewarna, farmaseutikal, organofosfat, kalis api, pelarut organik meruap, dan sebagainya. Ia dipancarkan ke atmosfera, ekosistem akuatik dan daratan di mana ia mempunyai kesan pelbagai dimensi, menyebabkan kesan buruk terhadap pelbagai bioform melalui perubahan sifat fizikokimia dan struktur komuniti (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Banyak bahan pencemar aromatik mempunyai kesan yang kuat dan merosakkan terhadap banyak ekosistem/titik panas biodiversiti yang utuh (contohnya terumbu karang, lapisan ais Artik/Antartika, tasik gunung tinggi, sedimen laut dalam, dll.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Kajian geomikrobiologi terkini telah menunjukkan bahawa pemendapan bahan organik sintetik (contohnya bahan pencemar aromatik) dan terbitannya pada permukaan struktur buatan (persekitaran binaan) (contohnya tapak warisan budaya dan monumen yang diperbuat daripada granit, batu, kayu dan logam) mempercepatkan degradasinya (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Aktiviti manusia boleh meningkatkan dan memburukkan lagi degradasi biologi monumen dan bangunan melalui pencemaran udara dan perubahan iklim (Liu et al. 2020). Bahan pencemar organik ini bertindak balas dengan wap air di atmosfera dan mendap pada struktur, menyebabkan degradasi fizikal dan kimia bahan tersebut. Biodegradasi diiktiraf secara meluas sebagai perubahan yang tidak diingini dalam rupa dan sifat bahan yang disebabkan oleh organisma hidup yang menjejaskan pemeliharaannya (Pochon dan Jaton, 1967). Tindakan mikrob selanjutnya (metabolisme) sebatian ini boleh mengurangkan integriti struktur, keberkesanan pemuliharaan dan nilai budaya (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Sebaliknya, dalam beberapa kes, penyesuaian mikrob dan tindak balas terhadap struktur ini didapati bermanfaat kerana ia membentuk biofilem dan kerak pelindung lain yang mengurangkan kadar pereputan/penguraian (Martino, 2016). Oleh itu, pembangunan strategi pemuliharaan lestari jangka panjang yang berkesan untuk monumen batu, logam dan kayu memerlukan pemahaman yang menyeluruh tentang proses utama yang terlibat dalam proses ini. Berbanding dengan proses semula jadi (proses geologi, kebakaran hutan, letusan gunung berapi, tindak balas tumbuhan dan bakteria), aktiviti manusia mengakibatkan pembebasan sejumlah besar hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) dan karbon organik (OC) lain ke dalam ekosistem. Banyak PAH yang digunakan dalam pertanian (racun serangga dan racun perosak seperti DDT, atrazin, karbaril, pentaklorofenol, dll.), industri (minyak mentah, enap cemar/sisa minyak, plastik yang berasal dari petroleum, PCB, pemplastik, detergen, pembasmi kuman, fumigan, pewangi dan pengawet), produk penjagaan diri (pelindung matahari, pembasmi kuman, penghalau serangga dan kasturi polisiklik) dan peluru (bahan letupan seperti 2,4,6-TNT) merupakan xenobiotik berpotensi yang boleh memberi kesan kepada kesihatan planet (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna dan Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Senarai ini boleh diperluaskan untuk merangkumi sebatian yang berasal dari petroleum (minyak bahan api, pelincir, asfalt), bioplastik berat molekul tinggi dan cecair ionik (Amde et al., 2015). Jadual 1 menyenaraikan pelbagai bahan pencemar aromatik dan aplikasinya dalam pelbagai industri. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, pelepasan antropogenik sebatian organik meruap, serta karbon dioksida dan gas rumah hijau lain, telah mula meningkat (Dvorak et al., 2017). Walau bagaimanapun, kesan antropogenik jauh melebihi kesan semula jadi. Di samping itu, kami mendapati bahawa beberapa SOC kekal dalam banyak persekitaran alam sekitar dan telah dikenal pasti sebagai bahan pencemar yang muncul dengan kesan buruk terhadap biom (Rajah 1). Agensi alam sekitar seperti Agensi Perlindungan Alam Sekitar Amerika Syarikat (USEPA) telah memasukkan banyak bahan pencemar ini dalam senarai keutamaan mereka kerana sifat sitotoksik, genotoksik, mutagenik dan karsinogeniknya. Oleh itu, peraturan pelupusan yang ketat dan strategi yang berkesan untuk rawatan/penyingkiran sisa daripada ekosistem yang tercemar diperlukan. Pelbagai kaedah rawatan fizikal dan kimia seperti pirolisis, rawatan haba oksidatif, pengudaraan udara, penimbusan tapak pelupusan, pembakaran, dan sebagainya tidak berkesan dan mahal serta menghasilkan hasil sampingan yang menghakis, toksik dan sukar untuk dirawat. Dengan peningkatan kesedaran alam sekitar global, mikroorganisma yang mampu menguraikan bahan pencemar ini dan derivatifnya (seperti halogen, nitro, alkil dan/atau metil) semakin menarik perhatian (Fennell et al., 2004; Haritash dan Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Penggunaan mikroorganisma calon asli ini secara bersendirian atau dalam kultur campuran (koloni) untuk penyingkiran bahan pencemar aromatik mempunyai kelebihan dari segi keselamatan alam sekitar, kos, kecekapan, keberkesanan dan kemampanan. Penyelidik juga sedang meneroka penyepaduan proses mikrob dengan kaedah redoks elektrokimia, iaitu sistem bioelektrokimia (BES), sebagai teknologi yang menjanjikan untuk rawatan/penyingkiran bahan pencemar (Huang et al., 2011). Teknologi BES telah menarik perhatian yang semakin meningkat kerana kecekapannya yang tinggi, kos rendah, keselamatan alam sekitar, operasi suhu bilik, bahan bioserasi dan keupayaan untuk mendapatkan semula hasil sampingan yang berharga (contohnya, elektrik, bahan api dan bahan kimia) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Kemunculan alat/kaedah penjujukan genom daya pemprosesan tinggi dan omik telah memberikan banyak maklumat baharu tentang pengawalaturan genetik, proteomik dan fluksomik tindak balas pelbagai mikroorganisma pengurai. Menggabungkan alat ini dengan biologi sistem telah meningkatkan lagi pemahaman kita tentang pemilihan dan penalaan halus laluan katabolik sasaran dalam mikroorganisma (iaitu, reka bentuk metabolik) untuk mencapai biodegradasi yang cekap dan berkesan. Untuk mereka bentuk strategi bioremediasi yang berkesan menggunakan mikroorganisma calon yang sesuai, kita perlu memahami potensi biokimia, kepelbagaian metabolik, komposisi genetik dan ekologi (autoekologi/sinekologi) mikroorganisma.
Rajah 1. Sumber dan laluan PAH molekul rendah melalui pelbagai persekitaran dan pelbagai faktor yang mempengaruhi biota. Garis putus-putus mewakili interaksi antara elemen ekosistem.
Dalam ulasan ini, kami telah cuba meringkaskan data tentang degradasi PAH ringkas seperti naftalena dan naftalena tersubstitusi oleh pelbagai isolat bakteria yang merangkumi laluan metabolik dan kepelbagaian, enzim yang terlibat dalam degradasi, komposisi/kandungan dan kepelbagaian gen, tindak balas selular dan pelbagai aspek bioremediasi. Memahami tahap biokimia dan molekul akan membantu dalam mengenal pasti strain perumah yang sesuai dan kejuruteraan genetik selanjutnya untuk bioremediasi yang berkesan bagi bahan pencemar keutamaan tersebut. Ini akan membantu dalam membangunkan strategi untuk penubuhan konsortium bakteria khusus tapak untuk bioremediasi yang berkesan.
Kehadiran sebilangan besar sebatian aromatik toksik dan berbahaya (memenuhi peraturan Huckel 4n + 2π elektron, n = 1, 2, 3, …) menimbulkan ancaman serius kepada pelbagai media persekitaran seperti udara, tanah, sedimen, dan permukaan dan air bawah tanah (Puglisi et al., 2007). Sebatian ini mempunyai cincin benzena tunggal (monosiklik) atau berbilang cincin benzena (polisiklik) yang disusun dalam bentuk linear, sudut atau kluster dan mempamerkan kestabilan (kestabilan/ketidakstabilan) dalam persekitaran disebabkan oleh tenaga resonans negatif yang tinggi dan inertness (inertness), yang boleh dijelaskan oleh hidrofobisiti dan keadaan terkurang. Apabila cincin aromatik digantikan lagi dengan kumpulan metil (-CH3), karboksil (-COOH), hidroksil (-OH), atau sulfonat (-HSO3), ia menjadi lebih stabil, mempunyai afiniti yang lebih kuat untuk makromolekul, dan bioakumulatif dalam sistem biologi (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Beberapa hidrokarbon aromatik polisiklik berat molekul rendah (LMWAH), seperti naftalena dan derivatifnya [metilnaftalena, asid naftoik, naftalenasulfonat, dan 1-naftil N-metilkarbamat (karbaril)], telah dimasukkan dalam senarai bahan pencemar organik keutamaan oleh Agensi Perlindungan Alam Sekitar AS sebagai genotoksik, mutagenik, dan/atau karsinogenik (Cerniglia, 1984). Pelepasan kelas NM-PAH ini ke dalam persekitaran boleh mengakibatkan bioakumulasi sebatian ini di semua peringkat rantaian makanan, sekali gus menjejaskan kesihatan ekosistem (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Sumber dan laluan PAH kepada biota adalah terutamanya melalui migrasi dan interaksi antara komponen ekosistem yang berbeza seperti tanah, air bawah tanah, air permukaan, tanaman dan atmosfera (Arey dan Atkinson, 2003). Rajah 1 menunjukkan interaksi dan taburan PAH berat molekul rendah yang berbeza dalam ekosistem dan laluannya kepada pendedahan biota/manusia. PAH dimendapkan pada permukaan akibat pencemaran udara dan melalui migrasi (hanyut) pelepasan kenderaan, gas ekzos perindustrian (penggasan arang batu, pembakaran dan pengeluaran kok) dan pemendapannya. Aktiviti perindustrian seperti pembuatan tekstil sintetik, pewarna dan cat; pengawetan kayu; pemprosesan getah; aktiviti pembuatan simen; pengeluaran racun perosak; dan aplikasi pertanian adalah sumber utama PAH dalam sistem daratan dan akuatik (Bamforth dan Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Kajian telah menunjukkan bahawa tanah di kawasan pinggir bandar dan bandar, berhampiran lebuh raya, dan di bandar-bandar besar lebih mudah terdedah kepada hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) disebabkan oleh pelepasan daripada loji janakuasa, pemanasan kediaman, beban lalu lintas udara dan jalan raya, dan aktiviti pembinaan (Suman et al., 2016). (2008) menunjukkan bahawa PAH dalam tanah berhampiran jalan raya di New Orleans, Louisiana, Amerika Syarikat adalah setinggi 7189 μg/kg, manakala di ruang terbuka, ia hanya 2404 μg/kg. Begitu juga, tahap PAH setinggi 300 μg/kg telah dilaporkan di kawasan berhampiran tapak penggasan arang batu di beberapa bandar AS (Kanaly dan Harayama, 2000; Bamforth dan Singleton, 2005). Tanah dari pelbagai bandar di India seperti Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni dan Venkataraman, 2000) dan Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) telah dilaporkan mengandungi kepekatan PAH yang tinggi. Sebatian aromatik lebih mudah diserap ke dalam zarah tanah, bahan organik dan mineral tanah liat, justeru menjadi penyerap karbon utama dalam ekosistem (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Sumber utama PAH dalam ekosistem akuatik ialah kerpasan (kerpasan basah/kering dan wap air), larian bandar, pelepasan air sisa, cas semula air bawah tanah dan sebagainya (Srogi, 2007). Dianggarkan kira-kira 80% PAH dalam ekosistem marin berasal daripada kerpasan, pemendapan dan pelepasan sisa (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Kepekatan PAH yang lebih tinggi dalam air permukaan atau larut resapan dari tapak pelupusan sisa pepejal akhirnya bocor ke dalam air bawah tanah, menimbulkan ancaman kesihatan awam yang besar kerana lebih daripada 70% penduduk di Asia Selatan dan Tenggara meminum air bawah tanah (Duttagupta et al., 2019). Satu kajian terbaru oleh Duttagupta et al. (2020) terhadap analisis sungai (32) dan air bawah tanah (235) dari Bengal Barat, India, mendapati bahawa dianggarkan 53% penduduk bandar dan 44% penduduk luar bandar (berjumlah 20 juta penduduk) mungkin terdedah kepada naftalena (4.9–10.6 μg/L) dan terbitannya. Corak penggunaan tanah yang berbeza dan peningkatan pengekstrakan air bawah tanah dianggap sebagai faktor utama yang mengawal pengangkutan menegak (adveksi) PAH berat molekul rendah di bawah permukaan. Larian pertanian, pelepasan air sisa perbandaran dan perindustrian, dan pelepasan sisa pepejal/sampah didapati terjejas oleh PAH di lembangan sungai dan sedimen bawah permukaan. Pemendakan atmosfera memburukkan lagi pencemaran PAH. Kepekatan PAH yang tinggi dan derivatif alkilnya (51 jumlah keseluruhan) telah dilaporkan di sungai/kawasan tadahan air di seluruh dunia, seperti Sungai Fraser, Sungai Louan, Sungai Denso, Sungai Missouri, Sungai Anacostia, Sungai Ebro, dan Sungai Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Di dalam sedimen lembangan Sungai Ganges, naftalena dan fenantrena didapati paling ketara (dikesan dalam 70% sampel) (Duttagupta et al., 2019). Selain itu, kajian telah menunjukkan bahawa pengklorinan air minuman boleh menyebabkan pembentukan PAH beroksigen dan berklorin yang lebih toksik (Manoli dan Samara, 1999). PAH terkumpul dalam bijirin, buah-buahan dan sayur-sayuran hasil daripada penyerapan oleh tumbuhan daripada tanah, air bawah tanah dan hujan yang tercemar (Fismes et al., 2002). Banyak organisma akuatik seperti ikan, kupang, kerang dan udang tercemar dengan PAH melalui pengambilan makanan dan air laut yang tercemar, serta melalui tisu dan kulit (Mackay dan Fraser, 2000). Kaedah memasak/pemprosesan seperti memanggang, memanggang, mengasap, menggoreng, mengeringkan, membakar dan memasak dengan arang juga boleh menyebabkan sejumlah besar PAH dalam makanan. Ini sebahagian besarnya bergantung pada pilihan bahan pengasap, kandungan hidrokarbon fenolik/aromatik, prosedur memasak, jenis pemanas, kandungan lembapan, bekalan oksigen dan suhu pembakaran (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) juga telah dikesan dalam susu pada kepekatan yang berbeza-beza (0.75–2.1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Pengumpulan PAH ini dalam makanan juga bergantung pada sifat fizikokimia makanan, manakala kesan toksiknya berkaitan dengan fungsi fisiologi, aktiviti metabolik, penyerapan, pengedaran dan pengagihan badan (Mechini et al., 2011).
Ketoksikan dan kesan berbahaya hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) telah diketahui sejak sekian lama (Cherniglia, 1984). Hidrokarbon aromatik polisiklik berat molekul rendah (LMW-PAH) (dua hingga tiga cincin) boleh mengikat secara kovalen kepada pelbagai makromolekul seperti DNA, RNA dan protein dan bersifat karsinogenik (Santarelli et al., 2008). Disebabkan sifat hidrofobiknya, ia dipisahkan oleh membran lipid. Pada manusia, sitokrom P450 monooksigenase mengoksidakan PAH kepada epoksida, yang sebahagiannya sangat reaktif (contohnya, baediol epoksida) dan boleh menyebabkan transformasi sel normal kepada sel malignan (Marston et al., 2001). Di samping itu, produk transformasi PAH seperti kuinon, fenol, epoksida, diol, dan sebagainya adalah lebih toksik daripada sebatian induk. Sesetengah PAH dan perantaraan metaboliknya boleh menjejaskan hormon dan pelbagai enzim dalam metabolisme, sekali gus menjejaskan pertumbuhan, sistem saraf pusat, sistem pembiakan dan imun (Swetha dan Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Pendedahan jangka pendek kepada PAH berat molekul rendah telah dilaporkan menyebabkan fungsi paru-paru terjejas dan trombosis dalam kalangan pesakit asma dan meningkatkan risiko kanser kulit, paru-paru, pundi kencing dan gastrousus (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Kajian haiwan juga menunjukkan bahawa pendedahan PAH boleh memberi kesan buruk terhadap fungsi dan perkembangan pembiakan dan boleh menyebabkan katarak, kerosakan buah pinggang dan hati, serta jaundis. Pelbagai produk biotransformasi PAH seperti diol, epoksida, kuinon dan radikal bebas (kation) telah terbukti membentuk adduk DNA. Adduk yang stabil telah terbukti mengubah jentera replikasi DNA, manakala adduk yang tidak stabil boleh mendepurinasi DNA (terutamanya kepada adenina dan kadangkala kepada guanina); kedua-duanya boleh menghasilkan ralat yang membawa kepada mutasi (Schweigert et al. 2001). Selain itu, kuinon (benzo-/pan-) boleh menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS), menyebabkan kerosakan maut pada DNA dan makromolekul lain, sekali gus menjejaskan fungsi/daya hidup tisu (Ewa dan Danuta 2017). Pendedahan kronik kepada kepekatan rendah pirena, bifenil dan naftalena telah dilaporkan menyebabkan kanser pada haiwan uji kaji (Diggs et al. 2012). Disebabkan ketoksikan mautnya, pembersihan/penyingkiran PAH ini daripada tapak yang terjejas/tercemar adalah satu keutamaan.
Pelbagai kaedah fizikal dan kimia telah digunakan untuk menyingkirkan PAH daripada tapak/persekitaran yang tercemar. Proses seperti pembakaran, penyahklorinan, pengoksidaan UV, fiksasi dan pengekstrakan pelarut mempunyai banyak kelemahan, termasuk pembentukan hasil sampingan toksik, kerumitan proses, isu keselamatan dan peraturan, kecekapan yang rendah dan kos yang tinggi. Walau bagaimanapun, biodegradasi mikrob (dipanggil bioremediasi) merupakan pendekatan alternatif yang menjanjikan yang melibatkan penggunaan mikroorganisma dalam bentuk kultur atau koloni tulen. Berbanding dengan kaedah fizikal dan kimia, proses ini mesra alam, tidak invasif, kos efektif dan mampan. Bioremediasi boleh dijalankan di tapak yang terjejas (in situ) atau di tapak yang disediakan khas (ex situ) dan oleh itu dianggap sebagai kaedah pemulihan yang lebih mampan daripada kaedah fizikal dan kimia tradisional (Juhasz dan Naidu, 2000; Andreoni dan Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Memahami langkah-langkah metabolik mikrob yang terlibat dalam degradasi bahan pencemar aromatik mempunyai implikasi saintifik dan ekonomi yang sangat besar untuk kemampanan ekologi dan alam sekitar. Dianggarkan 2.1×1018 gram karbon (C) disimpan dalam sedimen dan sebatian organik (iaitu, minyak, gas asli dan arang batu, iaitu, bahan api fosil) di seluruh dunia, memberikan sumbangan yang ketara kepada kitaran karbon global. Walau bagaimanapun, perindustrian yang pesat, pengekstrakan bahan api fosil dan aktiviti manusia mengurangkan takungan karbon litosfera ini, melepaskan anggaran 5.5×1015 g karbon organik (sebagai bahan pencemar) ke atmosfera setiap tahun (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Kebanyakan karbon organik ini memasuki ekosistem daratan dan marin melalui pemendapan, pengangkutan dan larian. Di samping itu, bahan pencemar sintetik baharu yang berasal daripada bahan api fosil, seperti plastik, pemplastik dan penstabil plastik (ftalat dan isomernya), mencemarkan ekosistem marin, tanah dan akuatik serta biota mereka dengan serius, sekali gus memburukkan lagi risiko iklim global. Pelbagai jenis mikroplastik, nanoplastik, serpihan plastik dan produk monomer toksiknya yang berasal daripada polietilena tereftalat (PET) telah terkumpul di Lautan Pasifik antara Amerika Utara dan Asia Tenggara, membentuk "Great Pacific Garbage Patch", yang membahayakan hidupan marin (Newell et al., 2020). Kajian saintifik telah membuktikan bahawa tidak mungkin untuk menyingkirkan bahan pencemar/sisa tersebut melalui sebarang kaedah fizikal atau kimia. Dalam konteks ini, mikroorganisma yang paling berguna ialah mikroorganisma yang mampu memetabolismekan bahan pencemar secara oksidatif menjadi karbon dioksida, tenaga kimia dan hasil sampingan bukan toksik lain yang akhirnya memasuki proses kitaran nutrien lain (H, O, N, S, P, Fe, dll.). Oleh itu, memahami ekofisiologi mikrob bagi mineralisasi bahan pencemar aromatik dan kawalan alam sekitar adalah penting untuk menilai kitaran karbon mikrob, bajet karbon bersih dan risiko iklim masa hadapan. Memandangkan keperluan mendesak untuk menyingkirkan sebatian tersebut daripada alam sekitar, pelbagai eko-industri yang tertumpu pada teknologi bersih telah muncul. Secara alternatifnya, pemberdayaan sisa industri/bahan kimia sisa yang terkumpul dalam ekosistem (iaitu pendekatan sisa kepada kekayaan) dianggap sebagai salah satu tonggak ekonomi kitaran dan matlamat pembangunan lestari (Close et al., 2012). Oleh itu, memahami aspek metabolik, enzimatik dan genetik calon degradasi yang berpotensi ini adalah sangat penting untuk penyingkiran dan bioremediasi bahan pencemar aromatik yang berkesan.
Antara pelbagai bahan pencemar aromatik, kami memberi perhatian khusus kepada PAH bermolekul rendah seperti naftalena dan naftalena tersubstitusi. Sebatian ini merupakan komponen utama bahan api yang berasal dari petroleum, pewarna tekstil, produk pengguna, racun perosak (bawang kapur barus dan penghalau serangga), pemplastik dan tanin dan oleh itu meluas dalam banyak ekosistem (Preuss et al., 2003). Laporan terkini mengetengahkan pengumpulan kepekatan naftalena dalam sedimen akuifer, tanah air bawah tanah dan bawah permukaan, zon vadose dan dasar sungai, yang menunjukkan bioakumulasinya dalam persekitaran (Duttagupta et al., 2019, 2020). Jadual 2 meringkaskan sifat fizikokimia, aplikasi dan kesan kesihatan naftalena dan derivatifnya. Berbanding dengan PAH bermolekul tinggi yang lain, naftalena dan derivatifnya kurang hidrofobik, lebih larut dalam air dan tersebar luas dalam ekosistem, jadi ia sering digunakan sebagai substrat model untuk mengkaji metabolisme, genetik dan kepelbagaian metabolik PAH. Sebilangan besar mikroorganisma mampu memetabolismekan naftalena dan derivatifnya, dan maklumat komprehensif tersedia tentang laluan metabolik, enzim dan ciri pengawalseliaannya (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Di samping itu, naftalena dan derivatifnya ditetapkan sebagai sebatian prototaip untuk penilaian pencemaran alam sekitar kerana kelimpahan dan bioavailabilitinya yang tinggi. Agensi Perlindungan Alam Sekitar AS menganggarkan bahawa purata tahap naftalena adalah 5.19 μg setiap meter padu daripada asap rokok, terutamanya daripada pembakaran tidak lengkap, dan 7.8 hingga 46 μg daripada asap aliran sisi, manakala pendedahan kepada kreosot dan naftalena adalah 100 hingga 10,000 kali lebih tinggi (Preuss et al. 2003). Naftalena khususnya didapati mempunyai ketoksikan pernafasan dan karsinogenik khusus spesies, rantau, dan jantina. Berdasarkan kajian haiwan, Agensi Antarabangsa untuk Penyelidikan Kanser (IARC) telah mengklasifikasikan naftalena sebagai "karsinogen manusia yang mungkin" (Kumpulan 2B)1. Pendedahan kepada naftalena yang digantikan, terutamanya melalui penyedutan atau pemberian parenteral (oral), menyebabkan kecederaan tisu paru-paru dan meningkatkan kejadian tumor paru-paru pada tikus dan mencit (Program Toksikologi Kebangsaan 2). Kesan akut termasuk loya, muntah, sakit perut, cirit-birit, sakit kepala, kekeliruan, berpeluh banyak, demam, takikardia, dan sebagainya. Sebaliknya, racun serangga karbamat spektrum luas karbaril (1-naftil N-metilkarbamat) telah dilaporkan menjadi toksik kepada invertebrata akuatik, amfibia, lebah madu dan manusia dan telah terbukti menghalang asetilkolinesterase yang menyebabkan lumpuh (Smulders et al., 2003; Bulen dan Distel, 2011). Oleh itu, memahami mekanisme degradasi mikrob, pengawalaturan genetik, tindak balas enzimatik dan selular adalah penting untuk membangunkan strategi bioremediasi dalam persekitaran yang tercemar.
Jadual 2. Maklumat terperinci tentang sifat fizikokimia, kegunaan, kaedah pengenalpastian dan penyakit berkaitan naftalena dan derivatifnya.
Dalam niche yang tercemar, bahan pencemar aromatik hidrofobik dan lipofilik boleh menyebabkan pelbagai kesan selular pada mikrobiom persekitaran (komuniti), seperti perubahan dalam kebendairan membran, kebolehtelapan membran, pembengkakan dwilapisan lipid, gangguan pemindahan tenaga (rantai pengangkutan elektron/daya penggerak proton), dan aktiviti protein berkaitan membran (Sikkema et al., 1995). Di samping itu, beberapa perantaraan larut seperti katekol dan kuinon menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS) dan membentuk adduk dengan DNA dan protein (Penning et al., 1999). Oleh itu, kelimpahan sebatian sedemikian dalam ekosistem mengenakan tekanan terpilih pada komuniti mikrob untuk menjadi pengurai yang cekap pada pelbagai peringkat fisiologi, termasuk pengambilan/pengangkutan, transformasi intraselular, asimilasi/pemanfaatan, dan pengkompartmenan.
Carian pada Projek Pangkalan Data Ribosom-II (RDP-II) mendedahkan bahawa sejumlah 926 spesies bakteria telah diasingkan daripada media atau kultur pengayaan yang tercemar dengan naftalena atau derivatifnya. Kumpulan Proteobakteria mempunyai bilangan wakil tertinggi (n = 755), diikuti oleh Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10), dan bakteria tidak dikelaskan (8) (Rajah 2). Wakil γ-Proteobakteria (Pseudomonadales dan Xanthomonadales) mendominasi semua kumpulan Gram-negatif dengan kandungan G+C yang tinggi (54%), manakala Clostridiales dan Bacillales (30%) adalah kumpulan Gram-positif dengan kandungan G+C yang rendah. Pseudomonas (bilangan tertinggi, 338 spesies) dilaporkan mampu mendegradasi naftalena dan derivatif metilnya dalam pelbagai ekosistem tercemar (tar arang batu, petroleum, minyak mentah, enap cemar, tumpahan minyak, air sisa, sisa organik dan tapak pelupusan sampah) serta dalam ekosistem yang utuh (tanah, sungai, sedimen dan air bawah tanah) (Rajah 2). Selain itu, kajian pengayaan dan analisis metagenomik di beberapa kawasan ini mendedahkan bahawa spesies Legionella dan Clostridium yang tidak dikultur mungkin mempunyai kapasiti degradasi, menunjukkan keperluan untuk mengkultur bakteria ini bagi mengkaji laluan baharu dan kepelbagaian metabolik.
Rajah 2. Kepelbagaian taksonomi dan taburan ekologi wakil bakteria dalam persekitaran yang tercemar dengan naftalena dan derivatif naftalena.
Antara pelbagai mikroorganisma penguraian hidrokarbon aromatik, kebanyakannya mampu mengurai naftalena sebagai satu-satunya sumber karbon dan tenaga. Urutan peristiwa yang terlibat dalam metabolisme naftalena telah diterangkan untuk Pseudomonas sp. (strain: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 dan CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 dan strain lain (ND6 dan AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis dan Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Metabolisme dimulakan oleh dioksigenase berbilang komponen [naftalena dioksigenase (NDO), dioksigenase hidroksilasi cincin] yang memangkinkan pengoksidaan salah satu cincin aromatik naftalena menggunakan oksigen molekul sebagai substrat lain, menukar naftalena kepada cis-naftalenadiol (Rajah 3). Cis-dihidrodiol ditukar kepada 1,2-dihidroksinaftalena oleh dehidrogenase. Dioksigenase pembelahan cincin, 1,2-dihidroksinaftalena dioksigenase (12DHNDO), menukarkan 1,2-dihidroksinaftalena kepada asid 2-hidroksikromena-2-karboksilik. Isomerisasi cis-trans enzimatik menghasilkan trans-o-hidroksibenzilidenapiruvat, yang dibelah oleh hidratase aldolase kepada aldehid salisilik dan piruvat. Asid organik piruvat ialah sebatian C3 pertama yang berasal daripada rangka karbon naftalena dan diarahkan ke laluan karbon pusat. Di samping itu, salisilaldehida dehidrogenase yang bergantung kepada NAD+ menukarkan salisilaldehida kepada asid salisilik. Metabolisme pada peringkat ini dipanggil "laluan atas" degradasi naftalena. Laluan ini sangat biasa dalam kebanyakan bakteria penguraian naftalena. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa pengecualian; contohnya, dalam Bacillus hamburgii 2 termofilik, Degradasi naftalena dimulakan oleh naftalena 2,3-dioksigenase untuk membentuk 2,3-dihidroksinaftalena (Annweiler et al., 2000).
Rajah 3. Laluan degradasi naftalena, metilnaftalena, asid naftoik dan karbaryl. Nombor yang dilingkari mewakili enzim yang bertanggungjawab untuk penukaran naftalena dan terbitannya secara berjujukan kepada produk seterusnya. 1 — naftalena dioksigenase (NDO); 2, cis-dihidrodiol dehidrogenase; 3, 1,2-dihidroksinaftalena dioksigenase; 4, isomerase 2-hidrokromena-2-asid karboksilik; 5, trans-O-hidroksibenzilidenapiruvat hidratase aldolase; 6, salisilaldehida dehidrogenase; 7, salisilat 1-hidroksilase; 8, katekol 2,3-dioksigenase (C23DO); 9, semialdehid 2-hidroksimukonat dehidrogenase; 10, 2-oksopent-4-enoat hidratase; 11, 4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolase; 12, asetaldehid dehidrogenase; 13, katekol-1,2-dioksigenase (C12DO); 14, sikloisomerase mukonat; 15, mukonolakton delta-isomerase; 16, β-ketoadipatenolakton hidrolase; 17, β-ketoadipat suksinil-KoA transferase; 18, β-ketoadipat-KoA tiolase; 19, suksinil-KoA: asetil-KoA suksiniltransferase; 20, salisilat 5-hidroksilase; 21 – gentisat 1,2-dioksigenase (GDO); 22, isomerase maleilpiruvat; 23, fumarilpiruvat hidrolase; 24, metilnaftalena hidroksilase (NDO); 25, hidroksimetilnaftalena dehidrogenase; 26, naftaldehid dehidrogenase; 27, 3-formilsalisilik asid oksidase; 28, hidroksiisoftalat dekarboksilase; 29, karbaril hidrolase (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilase.
Bergantung pada organisma dan susunan genetiknya, asid salisilik yang terhasil dimetabolismekan selanjutnya sama ada melalui laluan katekol menggunakan salisilat 1-hidroksilase (S1H) atau melalui laluan gentisat menggunakan salisilat 5-hidroksilase (S5H) (Rajah 3). Oleh kerana asid salisilik merupakan perantara utama dalam metabolisme naftalena (laluan atas), langkah-langkah dari asid salisilik kepada perantara TCA sering dirujuk sebagai laluan bawah, dan gen-gen tersebut disusun menjadi satu operon. Adalah perkara biasa untuk melihat bahawa gen dalam operon laluan atas (nah) dan operon laluan bawah (sal) dikawal oleh faktor pengawalseliaan yang sama; contohnya, NahR dan asid salisilik bertindak sebagai pendorong, membolehkan kedua-dua operon memetabolismekan naftalena sepenuhnya (Phale et al., 2019, 2020).
Di samping itu, katekol dipecahkan secara kitaran kepada semialdehid 2-hidroksimukonat melalui laluan meta oleh katekol 2,3-dioksigenase (C23DO) (Yen et al., 1988) dan selanjutnya dihidrolisiskan oleh semialdehid 2-hidroksimukonat hidrolase untuk membentuk asid 2-hidroksipent-2,4-dienoik. 2-hidroksipent-2,4-dienoat kemudiannya ditukar kepada piruvat dan asetaldehid oleh hidratase (2-oksopent-4-enoat hidratase) dan aldolase (4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolase) dan kemudian memasuki laluan karbon pusat (Rajah 3). Secara alternatif, katekol dipecahkan secara kitaran kepada cis,cis-mukonat melalui laluan orto oleh katekol 1,2-oksigenase (C12DO). Sikloisomerase mukonat, isomerase mukonolakton, dan β-ketoadipat-nollakton hidrolase menukar cis,cis-mukonat kepada 3-oksoadipat, yang memasuki laluan karbon pusat melalui suksinil-CoA dan asetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Rajah 3).
Dalam laluan gentisat (2,5-dihidroksibenzoat), cincin aromatik dibelah oleh gentisat 1,2-dioksigenase (GDO) untuk membentuk maleilpiruvat. Produk ini boleh dihidrolisiskan secara langsung kepada piruvat dan malat, atau ia boleh diisomerisasi untuk membentuk fumarilpiruvat, yang kemudiannya boleh dihidrolisiskan kepada piruvat dan fumarat (Larkin dan Day, 1986). Pilihan laluan alternatif telah diperhatikan dalam kedua-dua bakteria Gram-negatif dan Gram-positif pada peringkat biokimia dan genetik (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Bakteria Gram-negatif (Pseudomonas) lebih suka menggunakan asid salisilik, yang merupakan pendorong metabolisme naftalena, mendekarboksilasinya kepada katekol menggunakan salisilat 1-hidroksilase (Gibson dan Subramanian, 1984). Sebaliknya, dalam bakteria Gram-positif (Rhodococcus), salisilat 5-hidroksilase menukarkan asid salisilik kepada asid gentisik, manakala asid salisilik tidak mempunyai kesan induktif terhadap transkripsi gen naftalena (Grund et al., 1992) (Rajah 3).
Telah dilaporkan bahawa spesies seperti Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas dan spesies Mycobacterium boleh mendegradasi monomethylnaphthalene atau dimethylnaphthalene (Dean-Raymond dan Bartha, 1975; Cane dan Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Antaranya, laluan degradasi 1-metilnaphthalene dan 2-metilnaphthalene bagi Pseudomonas sp. CSV86 telah dikaji dengan jelas pada tahap biokimia dan enzimatik (Mahajan et al., 1994). 1-Metilnaphthalene dimetabolismekan melalui dua laluan. Pertama, cincin aromatik dihidroksilasi (cincin metilnaftalena yang tidak tergantikan) untuk membentuk cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalena, yang selanjutnya dioksidakan kepada metil salisilat dan metilkatekol, dan kemudian memasuki laluan karbon pusat selepas pembelahan cincin (Rajah 3). Laluan ini dipanggil "laluan sumber karbon". Dalam "laluan detoksifikasi" kedua, kumpulan metil boleh dihidroksilasi oleh NDO untuk membentuk 1-hidroksimetilnaftalena, yang selanjutnya dioksidakan kepada asid 1-naftoik dan diekskresikan ke dalam medium kultur sebagai produk buntu. Kajian telah menunjukkan bahawa strain CSV86 tidak dapat tumbuh pada asid 1- dan 2-naftoik sebagai satu-satunya sumber karbon dan tenaga, mengesahkan laluan detoksifikasinya (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). Dalam 2-metilnaftalena, kumpulan metil mengalami hidroksilasi oleh hidroksilase untuk membentuk 2-hidroksimetilnaftalena. Di samping itu, cincin naftalena yang tidak tersubstitusi mengalami hidroksilasi cincin untuk membentuk dihidrodiol, yang dioksidakan kepada 4-hidroksimetilkatekol dalam satu siri tindak balas yang dimangkinkan oleh enzim dan memasuki laluan karbon pusat melalui laluan pembelahan meta-cincin. Begitu juga, S. paucimobilis 2322 dilaporkan menggunakan NDO untuk menghidroksilat 2-metilnaftalena, yang selanjutnya dioksidakan untuk membentuk metil salisilat dan metilkatekol (Dutta et al., 1998).
Asid naftoik (diganti/tidak diganti) ialah hasil sampingan detoksifikasi/biotransformasi yang terbentuk semasa degradasi metilnaftalena, fenantrena dan antrasena dan dilepaskan ke dalam medium kultur terpakai. Telah dilaporkan bahawa isolat tanah Stenotrophomonas maltophilia CSV89 mampu memetabolismekan asid 1-naftoik sebagai sumber karbon (Phale et al., 1995). Metabolisme bermula dengan dihidroksilasi cincin aromatik untuk membentuk 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalena. Diol yang terhasil dioksidakan kepada katekol melalui 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenapiruvat, asid 3-formilsalisilik, asid 2-hidroksiisoftalik dan asid salisilik dan memasuki laluan karbon pusat melalui laluan pembelahan meta-cincin (Rajah 3).
Karbaril ialah racun perosak naftil karbamat. Sejak Revolusi Hijau di India pada tahun 1970-an, penggunaan baja kimia dan racun perosak telah menyebabkan peningkatan pelepasan hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) daripada sumber bukan titik pertanian (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Dianggarkan 55% (85,722,000 hektar) daripada jumlah tanah pertanian di India dirawat dengan racun perosak kimia. Sepanjang lima tahun yang lalu (2015–2020), sektor pertanian India telah menggunakan purata 55,000 hingga 60,000 tan racun perosak setiap tahun (Jabatan Koperasi dan Kebajikan Peladang, Kementerian Pertanian, Kerajaan India, Ogos 2020). Di dataran Gangetik utara dan tengah (negeri-negeri dengan populasi dan kepadatan penduduk tertinggi), penggunaan racun perosak pada tanaman adalah meluas, dengan racun perosak mendominasi. Carbaryl (1-naphthyl-N-methylcarbamate) ialah racun serangga karbamat spektrum luas, sederhana hingga sangat toksik yang digunakan dalam pertanian India pada kadar purata 100–110 tan. Ia biasanya dijual di bawah nama dagangan Sevin dan digunakan untuk mengawal serangga (aphid, semut api, kutu, hama, labah-labah dan banyak lagi perosak luar yang lain) yang menjejaskan pelbagai tanaman (jagung, kacang soya, kapas, buah-buahan dan sayur-sayuran). Sesetengah mikroorganisma seperti Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus dan Arthrobacter juga boleh digunakan untuk mengawal perosak lain. Telah dilaporkan bahawa RC100 boleh mendegradasi karbaril (Larkin dan Day, 1986; Chapalamadugu dan Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha dan Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Laluan degradasi karbaril telah dikaji secara meluas pada tahap biokimia, enzimatik dan genetik dalam isolat tanah bagi Pseudomonas sp. Strain C4, C5 dan C6 (Swetha dan Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Rajah 3). Laluan metabolik bermula dengan hidrolisis ikatan ester oleh karbaril hidrolase (CH) untuk membentuk 1-naftol, metilamina dan karbon dioksida. 1-naftol kemudiannya ditukar kepada 1,2-dihidroksinaftalena oleh 1-naftol hidroksilase (1-NH), yang selanjutnya dimetabolismekan melalui laluan karbon pusat melalui salisilat dan gentisat. Sesetengah bakteria pengurai karbaryl telah dilaporkan memetabolismekannya kepada asid salisilik melalui pembelahan cincin orto katekol (Larkin dan Day, 1986; Chapalamadugu dan Chaudhry, 1991). Terutamanya, bakteria pengurai naftalena terutamanya memetabolismekan asid salisilik melalui katekol, manakala bakteria pengurai karbaryl lebih suka memetabolismekan asid salisilik melalui laluan gentisat.
Derivatif asid naftalenasulfonik/asid disulfonik dan asid naftilaminsulfonik boleh digunakan sebagai perantaraan dalam penghasilan pewarna azo, agen pembasahan, penyebar, dan sebagainya. Walaupun sebatian ini mempunyai ketoksikan yang rendah kepada manusia, penilaian sitotoksisiti telah menunjukkan bahawa ia boleh membawa maut kepada ikan, daphnia dan alga (Greim et al., 1994). Wakil genus Pseudomonas (strain A3, C22) telah dilaporkan memulakan metabolisme melalui hidroksilasi berganda cincin aromatik yang mengandungi kumpulan asid sulfonik untuk membentuk dihidrodiol, yang kemudiannya ditukar kepada 1,2-dihidroksinaftalena melalui pembelahan spontan kumpulan sulfit (Brilon et al., 1981). 1,2-dihidroksinaftalena yang terhasil dikatabolismekan melalui laluan naftalena klasik, iaitu laluan katekol atau gentisat (Rajah 4). Telah ditunjukkan bahawa asid aminonaftalenasulfonik dan asid hidroksinaftalenasulfonik boleh didegradasi sepenuhnya oleh konsortium bakteria campuran dengan laluan katabolik pelengkap (Nortemann et al., 1986). Telah ditunjukkan bahawa seorang ahli konsortium menyahsulfurkan asid aminonaftalenasulfonik atau asid hidroksinaftalenasulfonik melalui 1,2-dioksigenasi, manakala aminosalicylate atau hidroksisalisilat dilepaskan ke dalam medium kultur sebagai metabolit buntu dan seterusnya diambil oleh ahli konsortium yang lain. Asid naftalenadisulfonik agak polar tetapi kurang terbiodegradasi dan oleh itu boleh dimetabolismekan melalui laluan yang berbeza. Penyahsulfuran pertama berlaku semasa dihidroksilasi regioselektif cincin aromatik dan kumpulan asid sulfonik; Penyahsulfuran kedua berlaku semasa hidroksilasi asid 5-sulfosalisilik oleh asid salisilik 5-hidroksilase untuk membentuk asid gentisik, yang memasuki laluan karbon pusat (Brilon et al., 1981) (Rajah 4). Enzim yang bertanggungjawab untuk degradasi naftalena juga bertanggungjawab untuk metabolisme naftalena sulfonat (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Rajah 4. Laluan metabolik untuk degradasi naftalena sulfonat. Nombor di dalam bulatan mewakili enzim yang bertanggungjawab untuk metabolisme naftil sulfonat, serupa/serupa dengan enzim yang diterangkan dalam Rajah 3.
PAH berat molekul rendah (LMW-PAH) boleh diturunkan, hidrofobik dan sukar larut, dan oleh itu tidak mudah terdedah kepada kerosakan/degradasi semula jadi. Walau bagaimanapun, mikroorganisma aerobik mampu mengoksidakannya dengan menyerap oksigen molekul (O2). Enzim-enzim ini kebanyakannya tergolong dalam kelas oksidoreduktase dan boleh melakukan pelbagai tindak balas seperti hidroksilasi cincin aromatik (mono- atau dihidroksilasi), dehidrogenasi dan pembelahan cincin aromatik. Produk yang diperoleh daripada tindak balas ini berada dalam keadaan pengoksidaan yang lebih tinggi dan lebih mudah dimetabolismekan melalui laluan karbon pusat (Phale et al., 2020). Enzim dalam laluan degradasi telah dilaporkan boleh diinduksi. Aktiviti enzim ini sangat rendah atau boleh diabaikan apabila sel ditumbuhkan pada sumber karbon mudah seperti glukosa atau asid organik. Jadual 3 meringkaskan pelbagai enzim (oksigenase, hidrolase, dehidrogenase, oksidase, dll.) yang terlibat dalam metabolisme naftalena dan derivatifnya.
Jadual 3. Ciri biokimia enzim yang bertanggungjawab terhadap degradasi naftalena dan derivatifnya.
Kajian radioisotop (18O2) telah menunjukkan bahawa penggabungan molekul O2 ke dalam cincin aromatik oleh oksigenase adalah langkah paling penting dalam mengaktifkan biodegradasi selanjutnya bagi sesuatu sebatian (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Penggabungan satu atom oksigen (O) daripada molekul oksigen (O2) ke dalam substrat dimulakan oleh monooksigenase endogen atau eksogen (juga dipanggil hidroksilase). Satu lagi atom oksigen dikurangkan kepada air. Monooksigenase eksogen mengurangkan flavin dengan NADH atau NADPH, manakala dalam endomonooksigenase, flavin dikurangkan oleh substrat. Kedudukan hidroksilasi menghasilkan kepelbagaian dalam pembentukan produk. Contohnya, salisilat 1-hidroksilase menghidroksilat asid salisilik pada kedudukan C1, membentuk katekol. Sebaliknya, salisilat 5-hidroksilase berbilang komponen (mengandungi subunit reduktase, feredoksin dan oksigenase) menghidroksilat asid salisilik pada kedudukan C5, membentuk asid gentisik (Yamamoto et al., 1965).
Dioksigenase menggabungkan dua atom O2 ke dalam substrat. Bergantung pada produk yang terbentuk, ia dibahagikan kepada dioksigenase hidroksilasi cincin dan dioksigenase pembelahan cincin. Dioksigenase hidroksilasi cincin menukar substrat aromatik kepada cis-dihidrodiol (contohnya, naftalena) dan tersebar luas di kalangan bakteria. Sehingga kini, telah ditunjukkan bahawa organisma yang mengandungi dioksigenase hidroksilasi cincin mampu tumbuh pada pelbagai sumber karbon aromatik, dan enzim ini dikelaskan sebagai NDO (naftalena), toluena dioksigenase (TDO, toluena), dan bifenil dioksigenase (BPDO, bifenil). Kedua-dua NDO dan BPDO boleh memangkinkan pengoksidaan berganda dan hidroksilasi rantai sisi pelbagai hidrokarbon aromatik polisiklik (toluena, nitrotoluena, xilena, etilbenzena, naftalena, bifenil, fluorena, indol, metilnaftalena, naftalenasulfonat, fenantrena, antrasena, asetofenon, dll.) (Boyd dan Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO ialah sistem berbilang komponen yang terdiri daripada oksidoreduktase, feredoksin dan komponen oksigenase yang mengandungi tapak aktif (Gibson dan Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Unit pemangkin NDO terdiri daripada subunit α yang besar dan subunit β kecil yang disusun dalam konfigurasi α3β3. NDO tergolong dalam keluarga besar oksigenase dan subunit α-nya mengandungi tapak Rieske [2Fe-2S] dan besi bukan heme mononuklear, yang menentukan kekhususan substrat NDO (Parales et al., 1998). Biasanya, dalam satu kitaran pemangkin, dua elektron daripada pengurangan nukleotida piridina dipindahkan ke ion Fe(II) dalam tapak aktif melalui reduktase, ferredoksin dan tapak Rieske. Setara penurunan mengaktifkan oksigen molekul, yang merupakan prasyarat untuk dihidroksilasi substrat (Ferraro et al., 2005). Sehingga kini, hanya beberapa NDO telah ditulenkan dan dicirikan secara terperinci daripada strain yang berbeza dan kawalan genetik laluan yang terlibat dalam degradasi naftalena telah dikaji secara terperinci (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Dioksigenase pembelahan cincin (enzim pembelahan endo- atau orto-cincin dan enzim pembelahan eksodiol atau meta-cincin) bertindak pada sebatian aromatik terhidroksilasi. Contohnya, dioksigenase pembelahan orto-cincin ialah katekol-1,2-dioksigenase, manakala dioksigenase pembelahan meta-cincin ialah katekol-2,3-dioksigenase (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Selain pelbagai oksigenase, terdapat juga pelbagai dehidrogenase yang bertanggungjawab untuk penyahhidrogenan dihidrodiol aromatik, alkohol dan aldehid dan menggunakan NAD+/NADP+ sebagai penerima elektron, yang merupakan antara enzim penting yang terlibat dalam metabolisme (Gibson dan Subramanian, 1984; Shaw dan Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzim seperti hidrolase (esterase, amidase) merupakan kelas enzim penting kedua yang menggunakan air untuk memutuskan ikatan kovalen dan mempamerkan kekhususan substrat yang luas. Hidrolase karbaril dan hidrolase lain dianggap sebagai komponen periplasma (transmembran) dalam ahli bakteria Gram-negatif (Kamini et al., 2018). Karbaril mempunyai ikatan amida dan ester; oleh itu, ia boleh dihidrolisiskan oleh esterase atau amidase untuk membentuk 1-naftol. Karbaril dalam strain Rhizobium rhizobium AC10023 dan strain Arthrobacter RC100 telah dilaporkan berfungsi sebagai esterase dan amidase. Karbaril dalam strain Arthrobacter RC100 juga berfungsi sebagai amidase. RC100 telah terbukti menghidrolisis empat racun serangga kelas N-metilkarbamat seperti karbaril, metomil, asid mefenamik dan XMC (Hayaatsu et al., 2001). Telah dilaporkan bahawa CH dalam Pseudomonas sp. C5pp boleh bertindak pada karbaril (aktiviti 100%) dan 1-naftil asetat (aktiviti 36%), tetapi tidak pada 1-naftilasetamida, menunjukkan bahawa ia adalah esterase (Trivedi et al., 2016).
Kajian biokimia, corak pengawalaturan enzim, dan analisis genetik telah menunjukkan bahawa gen degradasi naftalena terdiri daripada dua unit pengawalseliaan yang boleh diinduksi atau "operon": nah ("laluan hulu", menukar naftalena kepada asid salisilik) dan sal ("laluan hiliran", menukar asid salisilik kepada laluan karbon pusat melalui katekol). Asid salisilik dan analognya boleh bertindak sebagai pendorong (Shamsuzzaman dan Barnsley, 1974). Dengan kehadiran glukosa atau asid organik, operon ditindas. Rajah 5 menunjukkan organisasi genetik lengkap degradasi naftalena (dalam bentuk operon). Beberapa varian/bentuk gen nah yang dinamakan (ndo/pah/dox) telah diterangkan dan didapati mempunyai homologi jujukan yang tinggi (90%) di kalangan semua spesies Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Gen laluan hulu naftalena secara amnya disusun dalam susunan konsensus seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5A. Satu lagi gen, nahQ, juga dilaporkan terlibat dalam metabolisme naftalena dan biasanya terletak di antara nahC dan nahE, tetapi fungsi sebenarnya masih belum dapat dijelaskan. Begitu juga, gen nahY, yang bertanggungjawab untuk kemotaksis sensitif naftalena, ditemui di hujung distal operon nah dalam beberapa ahli. Dalam Ralstonia sp., gen U2 yang mengekod glutation S-transferase (gsh) didapati terletak di antara nahAa dan nahAb tetapi tidak menjejaskan ciri penggunaan naftalena (Zylstra et al., 1997).
Rajah 5. Organisasi genetik dan kepelbagaian yang diperhatikan semasa degradasi naftalena antara spesies bakteria; (A) Laluan naftalena atas, metabolisme naftalena kepada asid salisilik; (B) Laluan naftalena bawah, asid salisilik melalui katekol ke laluan karbon pusat; (C) asid salisilik melalui gentisat ke laluan karbon pusat.
"Laluan bawah" (operon sal) biasanya terdiri daripada nahGTHINLMOKJ dan menukarkan salisilat kepada piruvat dan asetaldehid melalui laluan belahan meta katekol. Gen nahG (pengekod salisilat hidroksilase) didapati terpelihara pada hujung proksimal operon (Rajah 5B). Berbanding dengan strain penguraian naftalena yang lain, dalam P. putida CSV86, operon nah dan sal adalah tandem dan sangat berkait rapat (kira-kira 7.5 kb). Dalam beberapa bakteria Gram-negatif, seperti Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2, dan P. putida AK5, naftalena dimetabolismekan sebagai metabolit karbon pusat melalui laluan gentisat (dalam bentuk operon sgp/nag). Kaset gen biasanya diwakili dalam bentuk nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, di mana nagR (pengekodan pengawal selia jenis LysR) terletak di hujung atas (Rajah 5C).
Karbaril memasuki kitaran karbon pusat melalui metabolisme 1-naftol, 1,2-dihidroksinaftalena, asid salisilik dan asid gentisik (Rajah 3). Berdasarkan kajian genetik dan metabolik, telah dicadangkan untuk membahagikan laluan ini kepada "hulu" (penukaran karbaril kepada asid salisilik), "tengah" (penukaran asid salisilik kepada asid gentisik), dan "hiliran" (penukaran asid gentisik kepada perantaraan laluan karbon pusat) (Singh et al., 2013). Analisis genomik C5pp (supercontig A, 76.3 kb) mendedahkan bahawa gen mcbACBDEF terlibat dalam penukaran karbaril kepada asid salisilik, diikuti oleh mcbIJKL dalam penukaran asid salisilik kepada asid gentisik, dan mcbOQP dalam penukaran asid gentisik kepada perantaraan karbon pusat (fumarat dan piruvat, Trivedi et al., 2016) (Rajah 6).
Telah dilaporkan bahawa enzim yang terlibat dalam degradasi hidrokarbon aromatik (termasuk naftalena dan asid salisilik) boleh diinduksi oleh sebatian yang sepadan dan dihalang oleh sumber karbon ringkas seperti glukosa atau asid organik (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Antara pelbagai laluan metabolik naftalena dan derivatifnya, ciri pengawalseliaan naftalena dan karbaril telah dikaji sehingga tahap tertentu. Bagi naftalena, gen dalam kedua-dua laluan huluan dan hiliran dikawal oleh NahR, pengawal selia positif bertindak-transaksi jenis LysR. Ia diperlukan untuk induksi gen nah oleh asid salisilik dan ekspresi peringkat tinggi berikutnya (Yen dan Gunsalus, 1982). Tambahan pula, kajian telah menunjukkan bahawa faktor hos integratif (IHF) dan XylR (pengawal selia transkripsi yang bergantung kepada sigma 54) juga penting untuk pengaktifan transkripsi gen dalam metabolisme naftalena (Ramos et al., 1997). Kajian telah menunjukkan bahawa enzim laluan pembukaan meta-cincin katekol, iaitu katekol 2,3-dioksigenase, diinduksi dengan kehadiran naftalena dan/atau asid salisilik (Basu et al., 2006). Kajian telah menunjukkan bahawa enzim laluan pembukaan orto-cincin katekol, iaitu katekol 1,2-dioksigenase, diinduksi dengan kehadiran asid benzoik dan cis,cis-mukonat (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Dalam strain C5pp, lima gen, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR dan mcbS, mengekod pengawal selia yang tergolong dalam keluarga LysR/TetR bagi pengawal selia transkripsi yang bertanggungjawab untuk mengawal degradasi karbaril. Gen homolog mcbG didapati paling berkait rapat dengan pengawal selia jenis LysR PhnS (58% identiti asid amino) yang terlibat dalam metabolisme fenantrena dalam Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Gen mcbH didapati terlibat dalam laluan perantaraan (penukaran asid salisilik kepada asid gentisik) dan tergolong dalam pengawal selia transkripsi jenis LysR NagR/DntR/NahR dalam Pseudomonas dan Burkholderia. Ahli keluarga ini dilaporkan mengenali asid salisilik sebagai molekul efektor khusus untuk induksi gen degradasi. Sebaliknya, tiga gen, mcbN, mcbR dan mcbS, yang tergolong dalam pengawal selia transkripsi jenis LysR dan TetR, telah dikenal pasti dalam laluan hiliran (metabolit laluan karbon pusat gentisat).
Dalam prokariot, proses pemindahan gen mendatar (pemerolehan, pertukaran atau pemindahan) melalui plasmid, transposon, profaj, pulau genomik dan unsur konjugatif integratif (ICE) merupakan punca utama keplastikan dalam genom bakteria, yang membawa kepada penambahan atau kehilangan fungsi/sifat tertentu. Ia membolehkan bakteria menyesuaikan diri dengan cepat kepada keadaan persekitaran yang berbeza, memberikan potensi kelebihan metabolik adaptif kepada perumah, seperti degradasi sebatian aromatik. Perubahan metabolik sering dicapai melalui penalaan halus operon degradasi, mekanisme pengawalseliaannya dan kekhususan enzim, yang memudahkan degradasi pelbagai sebatian aromatik (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Kaset gen untuk degradasi naftalena didapati terletak pada pelbagai unsur mudah alih seperti plasmid (konjugatif dan bukan konjugatif), transposon, genom, ICE dan gabungan spesies bakteria yang berbeza (Rajah 5). Dalam Pseudomonas G7, operon nah dan sal bagi plasmid NAH7 ditranskripsikan dalam orientasi yang sama dan merupakan sebahagian daripada transposon yang rosak yang memerlukan transposase Tn4653 untuk mobilisasi (Sota et al., 2006). Dalam strain Pseudomonas NCIB9816-4, gen tersebut ditemui pada plasmid konjugatif pDTG1 sebagai dua operon (kira-kira 15 kb antara satu sama lain) yang ditranskripsikan dalam arah yang bertentangan (Dennis dan Zylstra, 2004). Dalam strain Pseudomonas putida AK5, plasmid bukan konjugatif pAK5 mengekod enzim yang bertanggungjawab untuk degradasi naftalena melalui laluan gentisat (Izmalkova et al., 2013). Dalam strain Pseudomonas PMD-1, operon nah terletak pada kromosom, manakala operon sal terletak pada plasmid konjugatif pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Walau bagaimanapun, dalam Pseudomonas stutzeri AN10, semua gen degradasi naftalena (operon nah dan sal) terletak pada kromosom dan mungkin direkrut melalui peristiwa transposisi, rekombinasi dan penyusunan semula (Bosch et al., 2000). Dalam Pseudomonas sp. CSV86, operon nah dan sal terletak dalam genom dalam bentuk ICE (ICECSV86). Struktur ini dilindungi oleh tRNAGly diikuti oleh ulangan langsung yang menunjukkan tapak rekombinasi/perlekatan (attR dan attL) dan integrase seperti faj yang terletak di kedua-dua hujung tRNAGly, justeru strukturnya serupa dengan unsur ICEclc (ICEclcB13 dalam Pseudomonas knackmusii untuk degradasi klorokatekol). Telah dilaporkan bahawa gen pada ICE boleh dipindahkan melalui konjugasi dengan frekuensi pemindahan yang sangat rendah (10-8), justeru memindahkan sifat degradasi kepada penerima (Basu dan Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Kebanyakan gen yang bertanggungjawab untuk degradasi karbaril terletak pada plasmid. Arthrobacter sp. RC100 mengandungi tiga plasmid (pRC1, pRC2 dan pRC300) yang mana dua plasmid konjugatif, pRC1 dan pRC2, mengekod enzim yang menukar karbaril kepada gentisat. Sebaliknya, enzim yang terlibat dalam penukaran gentisat kepada metabolit karbon pusat terletak pada kromosom (Hayaatsu et al., 1999). Bakteria daripada genus Rhizobium. Strain AC100, yang digunakan untuk penukaran karbaril kepada 1-naftol, mengandungi plasmid pAC200, yang membawa gen cehA yang mengekod CH sebagai sebahagian daripada transposon Tnceh yang dikelilingi oleh jujukan seperti elemen sisipan (istA dan istB) (Hashimoto et al., 2002). Dalam strain Sphingomonas CF06, gen degradasi karbaril dipercayai terdapat dalam lima plasmid: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04, dan pCF05. Homologi DNA plasmid ini adalah tinggi, menunjukkan kewujudan peristiwa pertindihan gen (Feng et al., 1997). Dalam simbion penguraian karbaril yang terdiri daripada dua spesies Pseudomonas, strain 50581 mengandungi plasmid konjugatif pCD1 (50 kb) yang mengekod gen mcd karbaril hidrolase, manakala plasmid konjugatif dalam strain 50552 mengekod enzim penguraian 1-naftol (Chapalamadugu dan Chaudhry, 1991). Dalam strain Achromobacter WM111, gen mcd furadan hidrolase terletak pada plasmid 100 kb (pPDL11). Gen ini telah terbukti hadir pada plasmid yang berbeza (100, 105, 115 atau 124 kb) dalam bakteria yang berbeza dari kawasan geografi yang berbeza (Parekh et al., 1995). Dalam Pseudomonas sp. C5pp, semua gen yang bertanggungjawab untuk degradasi karbaril terletak dalam genom yang merangkumi 76.3 kb jujukan (Trivedi et al., 2016). Analisis genom (6.15 Mb) mendedahkan kehadiran 42 MGE dan 36 GEI, yang mana 17 MGE terletak dalam superkontigen A (76.3 kb) dengan kandungan G+C asimetri purata (54–60 mol%), menunjukkan kemungkinan peristiwa pemindahan gen mendatar (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 mempamerkan susunan gen penguraian karbaril yang serupa, tetapi gen ini terletak pada plasmid (Zhu et al., 2019).
Selain kecekapan metabolik pada tahap biokimia dan genomik, mikroorganisma juga mempamerkan sifat atau tindak balas lain seperti kemotaksis, sifat pengubahsuaian permukaan sel, pengasingan, penggunaan keutamaan, penghasilan biosurfaktan, dan sebagainya, yang membantu mereka memetabolismekan bahan pencemar aromatik dengan lebih cekap dalam persekitaran yang tercemar (Rajah 7).
Rajah 7. Strategi tindak balas selular yang berbeza bagi bakteria penguraian hidrokarbon aromatik yang ideal untuk biodegradasi sebatian pencemar asing yang cekap.
Tindak balas kemotaksis dianggap sebagai faktor yang meningkatkan degradasi bahan pencemar organik dalam ekosistem yang tercemar secara heterogen. (2002) menunjukkan bahawa kemotaksis Pseudomonas sp. G7 kepada naftalena meningkatkan kadar degradasi naftalena dalam sistem akuatik. Strain jenis liar G7 mendegradasi naftalena jauh lebih cepat daripada strain mutan kekurangan kemotaksis. Protein NahY (538 asid amino dengan topologi membran) didapati ditranskripsikan bersama dengan gen laluan metacleavage pada plasmid NAH7, dan seperti transduser kemotaksis, protein ini nampaknya berfungsi sebagai kemoreseptor untuk degradasi naftalena (Grimm dan Harwood 1997). Satu lagi kajian oleh Hansel et al. (2009) menunjukkan bahawa protein tersebut adalah kemotaksis, tetapi kadar degradasinya adalah tinggi. (2011) menunjukkan tindak balas kemotaktik Pseudomonas (P. putida) terhadap naftalena gas, di mana resapan fasa gas menghasilkan aliran naftalena yang stabil ke sel, yang mengawal tindak balas kemotaktik sel. Para penyelidik mengeksploitasi tingkah laku kemotaktik ini untuk merekayasa mikrob yang akan meningkatkan kadar degradasi. Kajian telah menunjukkan bahawa laluan kemosensori juga mengawal selia fungsi selular lain seperti pembahagian sel, pengawalaturan kitaran sel dan pembentukan biofilm, sekali gus membantu mengawal kadar degradasi. Walau bagaimanapun, memanfaatkan sifat ini (kemotaksis) untuk degradasi yang cekap terhalang oleh beberapa kesesakan. Halangan utama ialah: (a) reseptor paralog yang berbeza mengenali sebatian/ligan yang sama; (b) kewujudan reseptor alternatif, iaitu tropisme bertenaga; (c) perbezaan urutan yang ketara dalam domain deria keluarga reseptor yang sama; dan (d) kekurangan maklumat tentang protein sensor bakteria utama (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Kadangkala, biodegradasi hidrokarbon aromatik menghasilkan pelbagai metabolit/perantaraan, yang mungkin kemotaktik untuk satu kumpulan bakteria tetapi menjijikkan untuk kumpulan bakteria yang lain, seterusnya merumitkan proses tersebut. Untuk mengenal pasti interaksi ligan (hidrokarbon aromatik) dengan reseptor kimia, kami membina protein sensor hibrid (PcaY, McfR, dan NahY) dengan menggabungkan domain sensor dan isyarat Pseudomonas putida dan Escherichia coli, yang masing-masing mensasarkan reseptor untuk asid aromatik, perantaraan TCA, dan naftalena (Luu et al., 2019).
Di bawah pengaruh naftalena dan hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) yang lain, struktur membran bakteria dan integriti mikroorganisma mengalami perubahan yang ketara. Kajian telah menunjukkan bahawa naftalena mengganggu interaksi rantai asil melalui interaksi hidrofobik, sekali gus meningkatkan pembengkakan dan kebendairan membran (Sikkema et al., 1995). Untuk mengatasi kesan buruk ini, bakteria mengawal kebendairan membran dengan mengubah nisbah dan komposisi asid lemak antara asid lemak rantai bercabang iso/anteiso dan mengisomerasi asid lemak tak tepu cis menjadi isomer trans yang sepadan (Heipieper dan de Bont, 1994). Dalam Pseudomonas stutzeri yang ditanam pada rawatan naftalena, nisbah asid lemak tepu kepada tak tepu meningkat daripada 1.1 kepada 2.1, manakala dalam Pseudomonas JS150 nisbah ini meningkat daripada 7.5 kepada 12.0 (Mrozik et al., 2004). Apabila ditumbuhkan pada naftalena, sel Achromobacter KAs 3–5 mempamerkan pengagregatan sel di sekitar kristal naftalena dan penurunan cas permukaan sel (dari -22.5 kepada -2.5 mV) disertai dengan pemeluwapan sitoplasma dan vakuolisasi, menunjukkan perubahan dalam struktur sel dan sifat permukaan sel (Mohapatra et al., 2019). Walaupun perubahan selular/permukaan dikaitkan secara langsung dengan penyerapan bahan pencemar aromatik yang lebih baik, strategi biokejuruteraan yang berkaitan belum dioptimumkan sepenuhnya. Manipulasi bentuk sel jarang digunakan untuk mengoptimumkan proses biologi (Volke dan Nikel, 2018). Pemadaman gen yang mempengaruhi pembahagian sel menyebabkan perubahan dalam morfologi sel. Pemadaman gen yang mempengaruhi pembahagian sel menyebabkan perubahan dalam morfologi sel. Dalam Bacillus subtilis, protein septum sel SepF telah terbukti terlibat dalam pembentukan septum dan diperlukan untuk langkah pembahagian sel seterusnya, tetapi ia bukanlah gen penting. Pemotongan gen yang mengekod peptida glikan hidrolase dalam Bacillus subtilis mengakibatkan pemanjangan sel, peningkatan kadar pertumbuhan spesifik dan peningkatan kapasiti pengeluaran enzim (Cui et al., 2018).
Pembahagian laluan degradasi karbaril telah dicadangkan untuk mencapai degradasi strain Pseudomonas C5pp dan C7 yang cekap (Kamini et al., 2018). Adalah dicadangkan bahawa karbaril diangkut ke ruang periplasmik melalui septum membran luar dan/atau melalui porin yang boleh meresap. CH ialah enzim periplasmik yang memangkinkan hidrolisis karbaril kepada 1-naftol, yang lebih stabil, lebih hidrofobik dan lebih toksik. CH terletak di periplasma dan mempunyai afiniti yang rendah untuk karbaril, justeru mengawal pembentukan 1-naftol, justeru mencegah pengumpulannya dalam sel dan mengurangkan ketoksikannya kepada sel (Kamini et al., 2018). 1-naftol yang terhasil diangkut ke dalam sitoplasma merentasi membran dalam melalui pembahagian dan/atau resapan, dan kemudian dihidroksilasi kepada 1,2-dihidroksinaftalena oleh enzim afiniti tinggi 1NH untuk metabolisme selanjutnya dalam laluan karbon pusat.
Walaupun mikroorganisma mempunyai keupayaan genetik dan metabolik untuk menguraikan sumber karbon xenobiotik, struktur hierarki penggunaannya (iaitu, penggunaan sumber karbon mudah berbanding kompleks secara keutamaan) merupakan halangan utama kepada biodegradasi. Kehadiran dan penggunaan sumber karbon mudah menurunkan regulasi gen yang mengekod enzim yang menguraikan sumber karbon kompleks/bukan pilihan seperti PAH. Satu contoh yang dikaji dengan baik ialah apabila glukosa dan laktosa diberi makan bersama kepada Escherichia coli, glukosa digunakan dengan lebih cekap daripada laktosa (Jacob dan Monod, 1965). Pseudomonas telah dilaporkan menguraikan pelbagai PAH dan sebatian xenobiotik sebagai sumber karbon. Hierarki penggunaan sumber karbon dalam Pseudomonas ialah asid organik > glukosa > sebatian aromatik (Hylemon dan Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Walau bagaimanapun, terdapat pengecualian. Menariknya, Pseudomonas sp. CSV86 mempamerkan struktur hierarki unik yang secara pilihan menggunakan hidrokarbon aromatik (asid benzoik, naftalena, dll.) dan bukannya glukosa dan memetabolismekan hidrokarbon aromatik bersama asid organik (Basu et al., 2006). Dalam bakteria ini, gen untuk degradasi dan pengangkutan hidrokarbon aromatik tidak dikurangkan walaupun terdapat sumber karbon kedua seperti glukosa atau asid organik. Apabila ditumbuhkan dalam medium glukosa dan hidrokarbon aromatik, diperhatikan bahawa gen untuk pengangkutan dan metabolisme glukosa dikurangkan, hidrokarbon aromatik digunakan dalam fasa log pertama, dan glukosa digunakan dalam fasa log kedua (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Sebaliknya, kehadiran asid organik tidak mempengaruhi ekspresi metabolisme hidrokarbon aromatik, jadi bakteria ini dijangka menjadi strain calon untuk kajian biodegradasi (Phale et al., 2020).
Telah diketahui umum bahawa biotransformasi hidrokarbon boleh menyebabkan tekanan oksidatif dan peningkatan regulasi enzim antioksidan dalam mikroorganisma. Biodegradasi naftalena yang tidak cekap dalam sel fasa pegun dan dengan kehadiran sebatian toksik membawa kepada pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS) (Kang et al. 2006). Oleh kerana enzim pengurai naftalena mengandungi gugusan besi-sulfur, di bawah tekanan oksidatif, besi dalam heme dan protein besi-sulfur akan teroksida, yang membawa kepada penyahaktifan protein. Ferredoksin-NADP+ reduktase (Fpr), bersama-sama dengan superoksida dismutase (SOD), menjadi perantara tindak balas redoks boleh balik antara NADP+/NADPH dan dua molekul ferredoksin atau flavodoksin, sekali gus menyingkirkan ROS dan memulihkan pusat besi-sulfur di bawah tekanan oksidatif (Li et al. 2006). Telah dilaporkan bahawa kedua-dua Fpr dan SodA (SOD) dalam Pseudomonas boleh diinduksi oleh tekanan oksidatif, dan peningkatan aktiviti SOD dan katalase diperhatikan dalam empat strain Pseudomonas (O1, W1, As1, dan G1) semasa pertumbuhan di bawah keadaan tambahan naftalena (Kang et al., 2006). Kajian telah menunjukkan bahawa penambahan antioksidan seperti asid askorbik atau besi ferus (Fe2+) boleh meningkatkan kadar pertumbuhan naftalena. Apabila Rhodococcus erythropolis tumbuh dalam medium naftalena, transkripsi gen sitokrom P450 berkaitan tekanan oksidatif termasuk sodA (Fe/Mn superoksida dismutase), sodC (Cu/Zn superoksida dismutase), dan recA telah meningkat (Sazykin et al., 2019). Analisis proteomik kuantitatif perbandingan sel Pseudomonas yang dikultur dalam naftalena menunjukkan bahawa peningkatan regulasi pelbagai protein yang berkaitan dengan tindak balas tekanan oksidatif adalah strategi mengatasi tekanan (Herbst et al., 2013).
Mikroorganisma telah dilaporkan menghasilkan biosurfaktan di bawah tindakan sumber karbon hidrofobik. Surfaktan ini merupakan sebatian aktif permukaan amfifilik yang boleh membentuk agregat pada antara muka minyak-air atau udara-air. Ini menggalakkan pseudo-pelarutan dan memudahkan penjerapan hidrokarbon aromatik, menghasilkan biodegradasi yang cekap (Rahman et al., 2002). Disebabkan oleh sifat-sifat ini, biosurfaktan digunakan secara meluas dalam pelbagai industri. Penambahan surfaktan kimia atau biosurfaktan kepada kultur bakteria boleh meningkatkan kecekapan dan kadar degradasi hidrokarbon. Antara biosurfaktan, rhamnolipid yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa telah dikaji dan dicirikan secara meluas (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Selain itu, jenis biosurfaktan lain termasuk lipopeptida (musin daripada Pseudomonas fluorescens), pengemulsi 378 (daripada Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg dan Ron, 1999), lipid trehalosa disakarida daripada Rhodococcus (Ramdahl, 1985), likenin daripada Bacillus (Saraswathy dan Hallberg, 2002), dan surfaktan daripada Bacillus subtilis (Siegmund dan Wagner, 1991) dan Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Surfaktan kuat ini telah terbukti dapat mengurangkan tegangan permukaan daripada 72 dynes/cm kepada kurang daripada 30 dynes/cm, membolehkan penyerapan hidrokarbon yang lebih baik. Telah dilaporkan bahawa Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia dan spesies bakteria lain boleh menghasilkan pelbagai biosurfaktan berasaskan rhamnolipid dan glikolipid apabila ditanam dalam media naftalena dan metilnaftalena (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 boleh menghasilkan biosurfaktan ekstraselular Biosur-Pm apabila ditanam pada sebatian aromatik seperti asid naftoik (Phale et al., 1995). Kinetik pembentukan Biosur-Pm menunjukkan bahawa sintesisnya adalah proses yang bergantung kepada pertumbuhan dan pH. Didapati bahawa jumlah Biosur-Pm yang dihasilkan oleh sel pada pH neutral adalah lebih tinggi daripada pada pH 8.5. Sel yang tumbuh pada pH 8.5 adalah lebih hidrofobik dan mempunyai afiniti yang lebih tinggi untuk sebatian aromatik dan alifatik berbanding sel yang tumbuh pada pH 7.0. Dalam Rhodococcus spp. N6, nisbah karbon kepada nitrogen (C:N) yang lebih tinggi dan had zat besi adalah keadaan optimum untuk penghasilan biosurfaktan ekstraselular (Mutalik et al., 2008). Percubaan telah dibuat untuk meningkatkan biosintesis biosurfaktan (surfaktan) dengan mengoptimumkan strain dan penapaian. Walau bagaimanapun, titer surfaktan dalam medium kultur adalah rendah (1.0 g/L), yang menimbulkan cabaran untuk pengeluaran berskala besar (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Oleh itu, kaedah kejuruteraan genetik telah digunakan untuk meningkatkan biosintesisnya. Walau bagaimanapun, pengubahsuaian kejuruteraannya adalah sukar disebabkan oleh saiz operon yang besar (∼25 kb) dan pengawalaturan biosintetik sistem penderiaan kuorum yang kompleks (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Beberapa pengubahsuaian kejuruteraan genetik telah dijalankan dalam bakteria Bacillus, terutamanya bertujuan untuk meningkatkan penghasilan surfaktin dengan menggantikan promoter (operon srfA), mengekspres protein eksport surfaktin YerP secara berlebihan dan faktor pengawalseliaan ComX dan PhrC (Jiao et al., 2017). Walau bagaimanapun, kaedah kejuruteraan genetik ini hanya mencapai satu atau beberapa pengubahsuaian genetik dan belum mencapai pengeluaran komersial. Oleh itu, kajian lanjut tentang kaedah pengoptimuman berasaskan pengetahuan adalah perlu.
Kajian biodegradasi PAH kebanyakannya dijalankan di bawah keadaan makmal standard. Walau bagaimanapun, di tapak yang tercemar atau dalam persekitaran yang tercemar, banyak faktor abiotik dan biotik (suhu, pH, oksigen, ketersediaan nutrien, bioavailabiliti substrat, xenobiotik lain, perencatan produk akhir, dll.) telah terbukti mengubah dan mempengaruhi kapasiti degradasi mikroorganisma.
Suhu mempunyai kesan yang ketara terhadap biodegradasi PAH. Apabila suhu meningkat, kepekatan oksigen terlarut berkurangan, yang menjejaskan metabolisme mikroorganisma aerobik, kerana ia memerlukan oksigen molekul sebagai salah satu substrat untuk oksigenase yang menjalankan tindak balas hidroksilasi atau pembelahan cincin. Sering diperhatikan bahawa suhu yang tinggi menukarkan PAH induk kepada sebatian yang lebih toksik, sekali gus menghalang biodegradasi (Muller et al., 1998).
Telah diperhatikan bahawa banyak tapak yang tercemar PAH mempunyai nilai pH yang ekstrem, seperti tapak yang tercemar saliran lombong asid (pH 1–4) dan tapak penggasan gas asli/arang batu yang tercemar dengan larut resapan alkali (pH 8–12). Keadaan ini boleh menjejaskan proses biodegradasi dengan serius. Oleh itu, sebelum menggunakan mikroorganisma untuk bioremediasi, adalah disyorkan untuk melaraskan pH dengan menambah bahan kimia yang sesuai (dengan potensi pengurangan pengoksidaan sederhana hingga sangat rendah) seperti ammonium sulfat atau ammonium nitrat untuk tanah alkali atau pengapuran dengan kalsium karbonat atau magnesium karbonat untuk tapak berasid (Bowlen et al. 1995; Gupta dan Sar 2020).
Bekalan oksigen ke kawasan yang terjejas merupakan faktor pengehad kadar untuk biodegradasi PAH. Disebabkan oleh keadaan redoks persekitaran, proses bioremediasi in situ biasanya memerlukan pengenalan oksigen daripada sumber luaran (pengolahan, penyiraman udara, dan penambahan kimia) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) menunjukkan bahawa penambahan magnesium peroksida (sebatian pembebasan oksigen) kepada akuifer yang tercemar boleh membioremediasi sebatian BTEX dengan berkesan. Satu lagi kajian menyiasat degradasi in situ fenol dan BTEX dalam akuifer yang tercemar dengan menyuntik natrium nitrat dan membina telaga pengekstrakan untuk mencapai bioremediasi yang berkesan (Bewley dan Webb, 2001).