Sekarang†Alamat semasa: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Pusat Pengimejan Biologi Elektronik.
Kompleks penuaian cahaya pusat tindak balas 1 (RC-LH1) ialah komponen fotosintesis teras bakteria fototrofik ungu. Kami memperkenalkan dua struktur mikroskopi krio-elektron bagi kompleks RC-LH1 daripada Rhodopseudomonas palustris. Struktur resolusi 2.65-Å bagi kompleks RC-LH114-W terdiri daripada 14 gelung subunit LH1 yang mengelilingi RC, yang diganggu oleh protein W, manakala kompleks tanpa protein-W ialah komposisi RC sepenuhnya yang dikelilingi oleh RC. Gelung LH1 16 subunit tertutup. Perbandingan struktur ini memberikan pandangan tentang dinamik kuinon dalam kompleks RC-LH1, termasuk perubahan konformasi yang sebelum ini tidak ditentukan apabila mengikat kuinon di tapak QB RC, serta lokasi tapak pengikat kuinon tambahan, yang membantu menyampaikannya kepada RC. Struktur unik protein W menghalang penutupan gelung LH1, sekali gus mewujudkan saluran untuk mempercepatkan pertukaran kuinon/kuinolon.
Tenaga yang disediakan oleh fotosintesis dapat menampung hampir semua kehidupan di bumi, dan ia mempunyai potensi besar untuk bioteknologi solar. Sambil menggalakkan fotosintesis global, bakteria fototrofik ungu juga mempamerkan pelbagai mod tenaga dan keupayaan metabolik. Mereka boleh mengelakkan fotosintesis dan tumbuh sebagai bakteria heterotrofik dalam gelap, boleh mengikat nitrogen dan karbon dioksida, menghasilkan hidrogen, dan menguraikan sebatian aromatik (1-3). Untuk menyediakan tenaga untuk proses ini, cahaya mesti ditukar dengan cepat dan cekap menjadi tenaga kimia. Proses ini bermula apabila kompleks antena yang memerangkap cahaya menyerap cahaya dan memindahkan tenaga yang terperangkap ke pusat tindak balas (RC), sekali gus memulakan pemisahan cas (4 – 7). Unit asas fotosintesis dalam bakteria fototrofik ungu terdiri daripada RC jenis 2, dikelilingi oleh kompleks penuaian cahaya 1 (LH1), membentuk kompleks teras RC-LH1. LH1 dibentuk oleh susunan heterodimer αβ melengkung, setiap satunya mengikat dua molekul klorofil bakteria (BChl) dan satu atau dua karotenoid (8-12). Antena LH1 yang paling ringkas terdiri daripada 16 atau 17 heterodimer αβ yang mengelilingi RC (9-13) dalam gelung tertutup, tetapi dalam kompleks teras lain, peptida transmembran mengganggu kesinambungan LH1 di sekelilingnya, dengan itu menggalakkan resapan kuinol/kuinon antara kompleks RC dan sitokrom bc1 (11, 13-15). Tumbuhan fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) ialah organisma model yang boleh memahami pemindahan tenaga dan elektron yang menyokong fotosintesis. Struktur kristal pertama Rps. Model kompleks palustris RC-LH1 ialah RC, dikelilingi oleh 15 gelung LH1 heterodimerik, yang diganggu oleh protein yang tidak diketahui yang dipanggil "Protein W" (14). Protein-W kemudiannya dikenal pasti sebagai RPA4402, iaitu protein 10.5kDa yang tidak dicirikan dengan tiga heliks transmembran (TMH) yang diramalkan (16). Kami mencadangkan untuk menamakan semula gen rpa4402 yang mengekod protein W kepada pufW agar selaras dengan tatanama yang digunakan untuk gen yang mengekod subunit RC-L, M (pufL, pufM) dan LH1α, β (pufA, pufB). Menariknya, protein-W hanya terdapat dalam kira-kira 10% RC-LH1, mendedahkan Rps. palustris menghasilkan dua kompleks RC-LH1 yang berbeza. Di sini, kami melaporkan struktur krio-EM (krio-EM) resolusi tinggi bagi dua kompleks teras, satu dengan protein W dan 14 heterodimer αβ, yang satu lagi tanpa protein W dan gelung LH1 16 Heterodimer tertutup. Struktur kami mewakili perubahan langkah dalam pemahaman kompleks RC-LH1 Rps. palustris, kerana kami telah menganalisis populasi homogen bagi setiap varian dan mempunyai resolusi yang mencukupi untuk menetapkan setiap peptida dan pigmen terikat serta lipid dan kuinon yang berkaitan dengan jelas. Perbandingan struktur ini menunjukkan bahawa tiga protein TMH-W yang belum ditemui dalam mana-mana kompleks RC-LH1 lain setakat ini menghasilkan saluran kuinon untuk mempercepatkan pertukaran kuinon/kuinolon. Sejumlah tapak pengikatan lipid dan kuinon yang terpelihara telah dikenal pasti, dan kami telah mendedahkan perubahan konformasi baharu selepas gabungan kuinon dan RC, yang mungkin sesuai untuk fotosistem II (PSII) RC organisma fototrofik beroksigen. Penemuan kami memberikan pandangan baharu tentang kinetik pengikatan dan pertukaran kuinon/kuinolon dalam kompleks teras RC-LH1 bakteria fototrofik ungu.
Untuk memudahkan kajian terperinci tentang dua kompleks yang terdapat dalam Rps. palustris, kami mengasingkan setiap RC-LH1 melalui kaedah biokimia. Kompleks kekurangan protein W (selepas ini dirujuk sebagai ΔpufW) telah ditulenkan daripada strain yang kekurangan gen pufW (16), dan hanya satu kompleks RC-LH1 yang boleh dihasilkan. Kompleks yang mengandungi protein W dihasilkan oleh strain. Protein W strain ini diubah suai dengan tag 10x His pada C-terminusnya, supaya kompleks yang mengandungi protein W boleh digabungkan secara berkesan dengan kebanyakan protein W yang kekurangan dengan melumpuhkan logam. Kompleks ini diasingkan secara berkesan (16) Kromatografi Afiniti (IMAC).
Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, kedua-dua kompleks mengandungi tiga sub-unit RC (RC-L, RC-M dan RC-H) yang dikelilingi oleh antena LH1. Struktur 2.80-A bagi kompleks yang kekurangan protein-W menunjukkan 16 heterodimer αβ, membentuk gelung LH1 tertutup yang mengelilingi RC sepenuhnya, selepas ini dirujuk sebagai kompleks RC-LH116. Struktur 2.65Å bagi kompleks yang mengandungi protein-W mempunyai 14-heterodimer LH1 yang diganggu oleh protein-W, selepas ini dirujuk sebagai RC-LH114-W.
(A dan B) Perwakilan permukaan sebatian. (C dan D) Pigmen terikat yang diekspresikan dalam rod. (E dan F) Kompleks yang diperhatikan dari permukaan sitoplasma mempunyai peptida dan subunit LH1 yang diwakili dalam kartun, dan dinomborkan mengikut arah jam dari jurang protein-W [selaras dengan penomboran Rba. kompleks sphaeroides (13)]. Bagi LH1-α, warna subunit protein ialah kuning; bagi LH1-β, warna subunit protein ialah biru; bagi protein-W, protein ialah merah; bagi RC-H, ia ialah sian; bagi RC-L, ia ialah Oren; bagi RC-M, magenta. Kofaktor diwakili oleh rod, hijau mewakili molekul BChl dan BPh a, ungu mewakili karotenoid, dan kuning mewakili molekul UQ10. (G dan H) Pandangan pembesaran jurang protein-W dalam kawasan setara kompleks RC-LH114-W (G) dan kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor dipaparkan dalam bentuk pengisian ruang, kuinon berkelat dipaparkan dalam warna biru. Jurang protein-W diserlahkan oleh garis putus-putus biru dalam (G), dan lubang kecil di mana kuinon/kuinolol meresap pada cincin LH116 diserlahkan oleh garis putus-putus hitam dalam (H).
Rajah 1 (A dan B) menunjukkan RC yang dikelilingi oleh susunan heterodimer LH1αβ terbuka atau tertutup, yang setiap satunya mengikat dua BChl dan satu karotenoid (Rajah 1, C dan D). Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa Rps ialah kompleks LH1. Dalam laluan biosintesis spirulina xanthin, spesies ini mengandungi populasi campuran karotenoid (17). Walau bagaimanapun, spiropyrroxanthin ialah karotenoid dominan dan ketumpatannya adalah memuaskan. Oleh itu, kami memilih untuk memodelkan spiroxanthin di semua tapak pengikatan LH1. Polipeptida alfa dan beta ialah TMH tunggal dengan kawasan luar membran pendek (Rajah 1, A, B, E, dan F). Walaupun ketumpatan 17 residu pada C-terminus tidak diperhatikan, polipeptida alfa dibelah daripada Met1 kepada Ala46 dalam kedua-dua kompleks. Polipeptida β dikurangkan daripada Gly4 kepada Tyr52 dalam RC-LH116, dan daripada Ser5 kepada Tyr52 dalam RC-LH114-W. Tiada ketumpatan 3 atau 4 residu N-terminal atau 13 residu C-terminal diperhatikan (Rajah S1). Analisis spektrometri jisim kompleks campuran RC-LH1 yang disediakan daripada strain jenis liar menunjukkan bahawa kawasan yang hilang adalah hasil daripada pembelahan heterolog peptida ini (Rajah S1 dan S2). Formilasi N-terminal α-Met1 juga diperhatikan (f). Analisis menunjukkan bahawa α-peptida terdiri daripada residu fMet1 hingga Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, dan β-peptida terdiri daripada residu Ser2 hingga Ala53, yang sepadan dengan peta ketumpatan EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 dan β-His36 menjadikan BChl bersemuka; setiap heterodimer αβ berkumpul dengan jirannya untuk membentuk gelung terbuka (RC-LH114-W) atau gelung tertutup (RC-LH116) di sekeliling susunan pigmen gandingan exciton RC (Rajah 1, C dan D). Berbanding dengan jalur 877 nm RC-LH114-W, anjakan merah penyerapan 880 nm RC-LH116 ialah 3 nm (Rajah 2A). Walau bagaimanapun, spektrum dikroisme bulat hampir sama (Rajah 2B), menunjukkan bahawa walaupun terdapat perbezaan yang jelas antara gelung terbuka dan tertutup, persekitaran tempatan BChl sangat serupa. Anjakan merah penyerapan mungkin disebabkan oleh gerakan haba yang berkurangan dan peningkatan kestabilan pada gelung tertutup (18, 19), perubahan dalam gandingan pigmen yang disebabkan oleh gelung tertutup (20, 21), atau gabungan kedua-dua kesan ini (11).
(A) Spektrum penyerapan ultraungu/kelihatan/inframerah dekat, puncaknya ditandai dengan pigmen yang sepadan dan dinormalisasikan kepada puncak BPh pada 775 nm. (B) Spektrum dikroisme bulat dinormalisasikan kepada penyerapan BChl pada 805 nm. (C dan D) Spektrum ΔA yang dipilih daripada spektrum penyerapan masa yang diselesaikan bagi kompleks RC-LH114-W (C) dan kompleks RC-LH116 (D). Untuk perbandingan yang lebih baik, semua spektrum dinormalisasikan kepada ∆A bagi −A pada 0.2 ps. (E) Kadar pengoksidaan sitokrom c2 selepas penyinaran dengan kehadiran pelbagai kepekatan UQ2 (lihat Rajah S8 untuk data mentah). (F) Dalam sel yang ditumbuhkan di bawah cahaya keamatan rendah, sederhana atau tinggi (masing-masing 10, 30 atau 300μMm-2 s-1), subunit protein W dan RC-L dalam kompleks yang ditulenkan dan nisbah membran yang dipisahkan. Tentukan aras protein melalui elektroforesis gel SDS-poliakrilamida dan ujian imuno (lihat Rajah S9 untuk data mentah). Tentukan nisbah relatif kepada kompleks RC-LH114-W yang telah ditulenkan. Nisbah stoikiometri RC-L kepada protein-W kompleks ialah 1:1.
BChl pada kedudukan 1 dalam gelung αβ14 RC-LH114-W yang cacat (Rajah 1, A, C, dan E) adalah lebih dekat dengan penderma utama RC (P) sebanyak 6.8Å berbanding BChl yang setara dalam RC-LH116 (Rajah 1, B, D, dan F, dan Rajah S3); walau bagaimanapun, kinetik penyerapan sementara bagi kedua-dua kompleks menunjukkan bahawa bagi RC-LH114-W dan RC-LH116, pemalar masa pemindahan tenaga pengujaan dari LH1 ke RC ialah 40 ±4 dan 44 ±3 ps (Rajah 2). , C dan D, Rajah S4 dan Jadual S2). Tiada juga perbezaan yang ketara dalam pemindahan elektronik dalam RC (Rajah S5 dan teks tambahan berkaitan). Kami mengesyaki bahawa kesepadanan rapat masa pemindahan tenaga antara LH1 dan RC-P adalah disebabkan oleh jarak, sudut dan tenaga keupayaan yang serupa bagi kebanyakan BChl dalam dua gelung LH1. Nampaknya penerokaan corak tenaga LH1 untuk mencapai jarak minimum tidak lebih pantas daripada pemindahan tenaga langsung dari tapak suboptimum ke RC. Gelung LH1 gelung terbuka dalam RC-LH114-W juga mungkin mengalami gerakan haba yang tidak ketara di bawah keadaan suhu rendah untuk analisis struktur, dan terdapat konformasi cincin αβ14 yang lebih panjang pada suhu bilik dari jarak pigmentasi βBChls pada kedudukan RC 1.
Kompleks RC-LH116 mengandungi 32 BChl dan 16 karotenoid, dan susunan keseluruhannya adalah sama seperti yang diperoleh daripada Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), strain Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) dan alga hijau (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Selepas penjajaran, hanya sisihan kecil dalam kedudukan heterodimer αβ diperhatikan, terutamanya 1-5, 15, dan 16 (Rajah S6). Kehadiran protein-W mempunyai kesan yang ketara terhadap struktur LH1. Tiga TMHnya dihubungkan oleh gelung pendek, dengan terminal-N di bahagian lumen kompleks dan terminal-C di bahagian sitoplasma (Rajah 1A dan 3, A hingga D). Protein-W sebahagian besarnya hidrofobik (Rajah 3B), dan TMH2 dan TMH3 berinteraksi dengan LH1αβ-14 untuk membentuk permukaan transmembran (Rajah 3, B dan E hingga G). Antara muka ini terutamanya terdiri daripada residu Phe, Leu dan Val di kawasan transmembran. Residu ini disusun dengan asid amino hidrofobik dan pigmen αβ-14. Sesetengah residu polar juga menyumbang kepada interaksi tersebut, termasuk ikatan hidrogen antara W-Thr68 dan β-Trp42 pada permukaan rongga kompleks (Rajah 3, F dan G). Pada permukaan sitoplasma, Gln34 bersebelahan dengan kumpulan keto karotenoid αβ-14. Di samping itu, molekul n-dodesil β-d-maltosida (β-DDM) telah terlarut, dan ekor hidrofobiknya memanjang ke antara muka antara protein-W dan αβ-14, dan ekor lipid mungkin terletak di dalam badan. Kami juga mendapati bahawa kawasan resolusi C-terminal protein W dan RCH adalah sangat hampir, tetapi tidak dalam skop pembentukan interaksi tertentu (Rajah 1, A dan E). Walau bagaimanapun, mungkin terdapat interaksi dalam asid amino C-terminal yang tidak terselesaikan bagi kedua-dua protein ini, yang mungkin menyediakan mekanisme untuk perekrutan protein-W semasa pemasangan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, yang menghadap antara muka dengan LH1αβ14 dalam bentuk kartun, mempunyai rantai sisi berbentuk rod (merah), yang dipaparkan dalam sebahagian daripada gambar rajah potensi elektrostatik (permukaan kelabu lutsinar dengan aras kontur 0.13). (B) Protein-W diwakili oleh permukaan berwarna hidrofobik. Kawasan kutub dan bercas dipaparkan dalam warna sian, kawasan hidrofobik dipaparkan dalam warna putih, dan kawasan hidrofobik kuat dipaparkan dalam warna oren. (C dan D) Protein-W diwakili dalam kartun, orientasinya adalah sama seperti dalam (A) (C), dan diputarkan sebanyak 180° (D). Mengikut kedudukan dalam jujukan, residu yang boleh dibezakan menggunakan skema warna pelangi, di mana terminal-N berwarna biru dan terminal-C berwarna merah. (E) Protein-W dalam pandangan yang sama seperti dalam (A), dan residu pada antara muka protein-W:LH1 diwakili oleh rod dengan tanda yang dilampirkan. (F) Protein-W diputar 90° relatif kepada (E) dan LH1αβ14 dalam perwakilan kartun, dan relatif kepada residu antara muka dalam perwakilan bar. Residu yang tergantung daripada polipeptida beta dilabelkan. Kofaktor ditunjukkan sebagai bar yang sepadan dengan warna Rajah 1, β-DDM yang terurai ditunjukkan dalam warna kelabu, dan oksigen ditunjukkan dalam warna merah. (G) Pandangan dalam (F) diputar 180°, dengan residu polipeptida alfa yang berlabel menonjol.
Protein-W menggantikan heterodimer αβ (ke-15 dalam Rajah 1F), sekali gus menghalang penutupan gelung dan menyengetkan tiga heterodimer αβ pertama. Telah diperhatikan bahawa sudut kecenderungan maksimum heterodimer αβ-1 pertama relatif kepada filem normal ialah 25° hingga 29° (Rajah 1, A dan E), yang dibentuk oleh kecenderungan 2° hingga 8° αβ-1 dalam RC A kontras tajam-LH116 (Rajah 1, B dan F). Heterodimer kedua dan ketiga masing-masing condong pada 12° hingga 22° dan 5° hingga 10°. Disebabkan oleh halangan sterik RC, kecondongan αβ-1 tidak termasuk pasangan kedua αβ (yang sepadan dengan αβ ke-16 dalam Rajah 1F), sekali gus membentuk jurang yang jelas dalam cincin LH1 (Rajah 1, A dan E). Disebabkan kekurangan dua heterodimer αβ, disertai dengan kehilangan empat BChl dan dua karotenoid, tiada satu pun karotenoid yang terikat pada subunit αβ-1 yang berpintal, menghasilkan cincin LH114-W yang mengandungi 13 karotenoid Vegetarian dan 28 BChl. Anggaran resolusi tempatan bagi dua kompleks dalam kawasan αβ1 hingga 7 adalah lebih rendah daripada yang lain dalam gelung LH1, yang mungkin mencerminkan keplastikan semula jadi subunit LH1 bersebelahan dengan tapak RC QB (Rajah 4).
Gambar RC-LH114-W (A dan B) dan RC-LH116 (C dan D) ditunjukkan dari pandangan atas/pandangan sisi (A dan B) (A dan C) dan permukaan rongga yang sama seperti Rajah 1. (B dan D). Kekunci berwarna ditunjukkan di sebelah kanan.
Satu-satunya kompleks teras ciri lain dengan nisbah stoikiometrik 1:14 ialah dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Walau bagaimanapun, protein W dan PufX tidak mempunyai homologi yang jelas, dan mempunyai kesan yang ketara pada struktur LH1 masing-masing. PufX ialah TMH tunggal dengan domain sitoplasmik N-terminal yang berinteraksi dengan bahagian sitoplasmik subunit RC-H (13) pada kedudukan yang sepadan dengan Rps. palustris LH116αβ-16. PufX mewujudkan saluran untuk pertukaran kuinon/kuinolon antara RC-LH1 dan kompleks sitokrom bcl dan terdapat dalam semua kompleks teras Rba. sphaeroides (13). Walaupun antara muka monomer-monomer berada dalam Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX terletak pada kedudukan pengikatan protein W dalam RC-LH114-W, dan jurang yang disebabkan oleh PufX dan protein-W berada pada kedudukan yang setara (Rajah S7A). Jurang dalam RC-LH114-W juga sejajar dengan saluran kuinon hipotetikal (8) Pseudomonas rosea LH1, yang dibentuk oleh peptida yang tidak berkaitan dengan protein W atau PufX (Rajah S7B). Di samping itu, saluran kuinon dalam Blc. LH1 hijau zamrud yang dibentuk dengan mengecualikan satu subunit γ (7) terletak pada kedudukan yang serupa (Rajah S7C). Walaupun dimediasi oleh protein yang berbeza, kemunculan saluran kuinon/kuinolol ini dalam kedudukan yang sama dalam kompleks RC-LH1 nampaknya merupakan contoh evolusi konvergen, menunjukkan bahawa jurang yang dicipta oleh protein W mungkin bertindak sebagai saluran kuinon.
Jurang dalam gelung LH114-W membolehkan pembentukan kawasan membran berterusan antara ruang dalaman kompleks RC-LH114-W dan membran pukal (Rajah 1G), dan bukannya menghubungkan kedua-dua domain melalui liang protein seperti dalam protein. Kompleks RC-LH116 adalah serupa dengan kompleks seperti jarum Tch tertutup (22) (Rajah 1H). Oleh kerana resapan kuinon melalui membran adalah lebih cepat daripada resapan melalui saluran protein yang sempit, gelung LH114-W yang terbuka boleh membenarkan perolehan RC yang lebih cepat daripada gelung LH116 yang tertutup, dan resapan kuinon ke dalam RC mungkin lebih terhad. Untuk menguji sama ada protein W mempengaruhi penukaran kuinon melalui RC, kami menjalankan ujian pengoksidaan sitokrom pada kepekatan ubiquinone 2 (UQ2) tertentu (analog UQ10 semula jadi dengan ekor isoprena yang lebih pendek) (Rajah 2E). Walaupun kehadiran kuinon terkelat menghalang penentuan tepat pemalar Michaelis yang ketara (RC-LH114-W dan RC-LH116 sesuai untuk 0.2±0.1μM dan 0.5±0.2μM, masing-masing), kadar maksimum RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) adalah 28±5% lebih besar daripada RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Pada mulanya kami menganggarkan bahawa protein-W terdapat dalam kira-kira 10% daripada kompleks teras (16); di sini, kadar penghunian sel pertumbuhan cahaya rendah, cahaya sederhana, dan cahaya tinggi masing-masing adalah 15±0.6%, 11±1% dan 0.9±0.5% (Rajah 2F). Perbandingan kuantitatif spektrometri jisim menunjukkan bahawa penambahan tag histidin tidak mengurangkan kelimpahan relatif protein-W berbanding strain jenis liar (P = 0.59), jadi tahap ini bukanlah artifak protein-W yang diubah suai (Rajah S10). Walau bagaimanapun, penghunian protein-W yang rendah dalam kompleks RC-LH1 ini mungkin membolehkan sesetengah RC bertukar pada kadar yang dipercepatkan, sekali gus mengurangkan pertukaran kuinon/kuinolon yang lebih perlahan dalam kompleks RC-LH116. Kami mendapati bahawa kadar penghunian cahaya tinggi tidak konsisten dengan data transkriptomik terkini, yang menunjukkan bahawa ekspresi gen pufW meningkat di bawah cahaya yang kuat (Rajah S11) (23). Perbezaan antara transkripsi pufW dan penggabungan protein-W ke dalam kompleks RC-LH1 adalah mengelirukan dan mungkin mencerminkan pengawalaturan kompleks protein.
Dalam RC-LH114-W, 6 molekul kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolina (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) dan 29 molekul β-DDM diperuntukkan dan dimodelkan di dalamnya iaitu 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG dan 12 βDDM. RC-LH116 (Rajah 5, A dan B). Dalam kedua-dua struktur ini, CDL hampir terletak di bahagian sitoplasma kompleks, manakala POPC, POPG dan β-DDM kebanyakannya terletak di bahagian luminal. Dua molekul lipid dan detergen telah diasingkan di kawasan αβ-1 hingga αβ-6 bagi kompleks RC-LH114-W (Rajah 5A), dan lima telah diasingkan di kawasan setara RC-LH116 (Rajah 5B). Lebih banyak lipid ditemui di bahagian lain kompleks, terutamanya CDL, yang terkumpul antara RC dan αβ-7 hingga αβ-13 (Rajah 5, A dan B). Lipid dan detergen lain yang terselesaikan secara struktur terletak di luar cincin LH1, dan rantai asil yang terselesaikan dengan baik memanjang di antara subunit LH1, yang secara sementara ditetapkan sebagai β-DDM dalam RC-LH114-W, dan ditakrifkan sebagai β-DDM dalam campuran RC A bagi β-DDM dan POPC-LH116. Kedudukan lipid dan detergen pengkelat yang serupa dalam struktur kita menunjukkan bahawa ia adalah tapak pengikatan yang relevan secara fisiologi (Rajah S12A). Kedudukan molekul setara dalam Tch juga mempunyai konsistensi yang baik. Gentle dan Trv. Strain 970 RC-LH1s (Rajah S12, B hingga E) (9, 12) dan residu ikatan hidrogen bagi kumpulan kepala lipid menunjukkan pemuliharaan yang agak baik dalam penjajaran jujukan (Rajah S13), menunjukkan bahawa CDL terpelihara yang mengikat kepada RC (24), tapak ini mungkin terpelihara dalam kompleks RC-LH1.
(A dan B) Peptida RC-LH114-W (A) dan RC-LH116 (B) diwakili oleh kartun, dan pigmen diwakili oleh rod, menggunakan skema warna dalam Rajah 1. Lipid ditunjukkan dalam warna merah, dan detergen ditunjukkan dalam warna kelabu. UQ yang terikat pada tapak RC QA dan QB adalah kuning, manakala UQ terpencil adalah biru. (C dan D) Pandangan yang sama seperti (A) dan (B), dengan lipid diabaikan. (E ke G) Pandangan Q1(E), Q2(F) dan Q3(G) yang diperbesarkan daripada RC-LH116, dengan rantai sisi yang mempengaruhi antara satu sama lain. Ikatan hidrogen ditunjukkan sebagai garis putus-putus hitam.
Dalam RC-LH116, kedua-dua RC QA dan QB UQ, yang mengambil bahagian dalam pemindahan elektron dalam proses pemisahan cas, diuraikan di tapak pengikatannya. Walau bagaimanapun, dalam RC-LH114-W, kuinon QB belum dilarutkan dan akan dibincangkan secara terperinci di bawah. Selain kuinon QA dan QB, dua molekul UQ berkelat (terletak di antara cincin RC dan LH1) diperuntukkan dalam struktur RC-LH114-W mengikut kumpulan kepala yang dilarutkan dengan baik (masing-masing terletak di Q1 dan Q2). ruang). Rajah 5C). Dua unit isoprena diberikan kepada Q1, dan peta ketumpatan menyelesaikan 10 ekor isoprena lengkap Q2. Dalam struktur RC-LH116, tiga molekul UQ10 berkelat (Q1 hingga Q3, Rajah 5D) telah dilarutkan, dan semua molekul mempunyai ketumpatan jernih di seluruh ekor (Rajah 5, D hingga G). Dalam kedua-dua struktur tersebut, kedudukan kumpulan kepala kuinon Q1 dan Q2 mempunyai konsistensi yang sangat baik (Rajah S12F), dan ia hanya berinteraksi dengan RC. Q1 terletak di pintu masuk jurang W RC-LH114-W (Rajah 1G dan 5, C, D dan E), dan Q2 terletak berhampiran tapak pengikatan QB (Rajah 5, C, D) dan F). Residu L-Trp143 dan L-Trp269 yang terpelihara adalah sangat dekat dengan Q1 dan Q2 dan memberikan interaksi penyusunan π yang berpotensi (Rajah 5, E dan F, dan Rajah S12). L-Gln88, 3.0 Å daripada oksigen distal Q1, memberikan ikatan hidrogen yang kuat (Rajah 5E); residu ini terpelihara dalam semua RC kecuali hubungan yang paling jauh (Rajah S13). L-Ser91 digantikan secara konservatif untuk Thr dalam kebanyakan RC lain (Rajah S13), ialah 3.8 Angstrom daripada metil oksigen Q1, dan mungkin memberikan ikatan hidrogen yang lemah (Rajah 5E). Q3 nampaknya tidak mempunyai interaksi khusus, tetapi terletak di kawasan hidrofobik antara subunit RC-M dan subunit LH1-α 5 hingga 6 (Rajah 5, D dan G). Q1, Q2 dan Q3 atau kuinon berkelat berdekatan juga telah diselesaikan dalam Tch. Gentle, Trv. Strain 970 dan Blc. Struktur iris (9, 10, 12) menunjukkan tapak pengikatan kuinon tambahan yang terpelihara dalam kompleks RC-LH1 (Rajah S12G). Lima UQ terurai dalam RC-LH116 adalah selaras dengan 5.8±0.7 bagi setiap kompleks yang ditentukan oleh kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC), manakala tiga UQ terurai dalam RC-LH114-W adalah lebih rendah daripada . Nilai terukur 6.2±0.3 (Rajah S14) menunjukkan bahawa terdapat molekul UQ yang tidak terurai dalam struktur.
Polipeptida L dan M pseudo-simetri masing-masing mengandungi lima TMH dan membentuk heterodimer yang menggabungkan satu dimer BChl, dua monomer BChl, dua monomer bakteriofaj (BPh), dan satu molekul besi bukan Heme dan satu atau dua molekul UQ10. Melalui kehadiran ikatan hidrogen pada kumpulan keton terminal dan pengumpulannya yang diketahui dalam Rps, karotenoid digabungkan dalam subunit-M, yang dinamakan cis-3,4-dehidroorhodopin. Spesies (25). Domain membran luar RC-H berlabuh pada membran oleh satu TMH. Struktur RC keseluruhan adalah serupa dengan tiga subunit RC spesies yang berkaitan (seperti Rba). sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Makrokitar BChl dan BPh, tulang belakang karotenoid dan besi bukan heme bertindih dalam julat resolusi struktur ini, begitu juga kumpulan kepala UQ10 di tapak QA dan kuinon QB pada RC-LH116 (Rajah S15).
Ketersediaan dua struktur RC dengan kadar penghunian tapak QB yang berbeza memberikan peluang baharu untuk mengkaji perubahan konformasi yang konsisten yang mengiringi pengikatan QB kuinon. Dalam kompleks RC-LH116, QB kuinon terletak pada kedudukan "proksimal" yang terikat sepenuhnya (26), tetapi pemisahan RC-LH114-W tidak mempunyai QB kuinon. Tiada QB kuinon dalam RC-LH114-W, yang mengejutkan kerana kompleks ini aktif, lebih daripada kompleks RC-LH116 dengan QB kuinon yang terselesaikan secara struktur. Walaupun dua cincin LH1 berkelat kira-kira enam kuinon, lima terselesaikan secara struktur dalam cincin RC-LH116 yang tertutup, manakala hanya tiga yang terhad secara struktur dalam cincin RC-LH114-W yang terbuka. Peningkatan gangguan struktur ini mungkin mencerminkan penggantian tapak QB RC-LH114-W yang lebih pantas, kinetik kuinon yang lebih pantas dalam kompleks, dan peningkatan kemungkinan melintasi gelung LH1. Kami mencadangkan bahawa kekurangan UQ di tapak RC QB RC-LH114-W mungkin disebabkan oleh kompleks yang lebih kompleks dan lebih aktif, dan tapak QB RC-LH114-W telah serta-merta dibekukan dalam pusingan UQ. Peringkat khusus (pintu masuk ke tapak QB telah ditutup) mencerminkan konformasi aktiviti ini.
Tanpa QB, putaran L-Phe217 yang disertakan ke kedudukan yang tidak serasi dengan pengikatan UQ10, kerana ia akan menyebabkan perlanggaran ruang dengan unit isoprena pertama ekor (Rajah 6A). Di samping itu, perubahan konformasi utama yang jelas adalah jelas, terutamanya heliks de (heliks pendek dalam gelung antara TMH D dan E) di mana L-Phe217 dialihkan ke poket pengikatan QB dan putaran L-Tyr223 (Rajah 6A) Untuk memutuskan ikatan hidrogen dengan rangka kerja M-Asp45 dan menutup pintu masuk tapak pengikatan QB (Rajah 6B). Heliks de berpusing di pangkalnya, Cα L-Ser209 dialihkan sebanyak 0.33Å, manakala L-Val221Cα dialihkan sebanyak 3.52Å. Tiada perubahan yang boleh diperhatikan dalam TMH D dan E, yang boleh ditumpangkan dalam kedua-dua struktur (Rajah 6A). Setahu kami, ini adalah struktur pertama dalam RC semula jadi yang menutup tapak QB. Perbandingan dengan struktur lengkap (terikat QB) menunjukkan bahawa sebelum kuinon direduksi, perubahan konformasi diperlukan untuk menjadikannya memasuki kuinon. L-Phe217 berputar untuk membentuk interaksi susunan π dengan kumpulan kepala kuinon, dan heliks beralih ke luar, membolehkan rangka L-Gly222 dan rantai sisi L-Tyr223 membentuk rangkaian ikatan hidrogen dengan struktur ikatan hidrogen yang stabil (Rajah 6, A dan C).
(A) Kartun hologram bertindih (rantai L, oren/rantai M, magenta) dan struktur apo (kelabu), di mana residu utama dipaparkan dalam bentuk perwakilan seperti rod. UQ10 diwakili oleh bar kuning. Garis putus-putus menunjukkan ikatan hidrogen yang terbentuk dalam keseluruhan struktur. (B dan C) Perwakilan permukaan apolipoprotein dan keseluruhan struktur cincin, menonjolkan oksigen rantai sisi L-Phe217 dalam warna biru dan L-Tyr223 dalam warna merah. Subunit L berwarna oren; subunit M dan H tidak berwarna. (D dan E) Apolipoprotein (D) dan keseluruhan (E) tapak RC QB [warna mengikut (A) masing-masing] dan Thermophilus thermophilus PSII (hijau, biru dengan kuinon plastik; ID PDB: 3WU2) Jajarkan (58).
Tanpa diduga, walaupun terdapat beberapa struktur RC kekurangan QB tanpa LH1, perubahan konformasi yang diperhatikan dalam kajian ini belum dilaporkan sebelum ini. Ini termasuk struktur susutan QB daripada Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) dan Rba. sphaeroides (ID PDB: 1OGV) (29), yang semuanya hampir sama dengan struktur QB keseluruhannya. Pemeriksaan rapi terhadap 3PRC mendedahkan bahawa molekul detergen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) terikat pada pintu masuk kedudukan QB, yang boleh menghalang penyusunan semula kepada konformasi tertutup. Walaupun LDAO tidak terurai pada kedudukan yang sama dalam 1EYS atau 1OGV, RC ini disediakan menggunakan detergen yang sama dan oleh itu boleh menghasilkan kesan yang sama. Struktur kristal Rba. Sphaeroides RC yang dikristalisasi bersama dengan sitokrom c2 (ID PDB: 1L9B) juga nampaknya mempunyai tapak QB tertutup. Walau bagaimanapun, dalam kes ini, kawasan N-terminal polipeptida RC-M (berinteraksi dengan tapak pengikatan QB melalui ikatan H residu Tyr pada heliks Q) menerima pakai konformasi yang tidak semula jadi, dan perubahan konformasi QB tidak diterokai lebih lanjut (30). Apa yang meyakinkan ialah kita belum melihat ubah bentuk polipeptida M seperti ini dalam struktur RC-LH114-W, yang hampir sama dengan kawasan N-terminal RC-LH116 RC. Perlu juga diperhatikan bahawa selepas pembasmian antena LH1 berasaskan detergen, apolipoprotein RC dalam PDB telah diselesaikan, yang menghapuskan kolam kuinon dalaman dan lipid dalam jurang antara RC dan permukaan dalam cincin LH1 di sekelilingnya (31, 32). RC kekal berfungsi kerana ia mengekalkan semua kofaktor, kecuali kuinon QB yang boleh diurai, yang kurang stabil dan sering hilang semasa proses penyediaan (33). Di samping itu, diketahui bahawa penyingkiran LH1 dan lipid kitaran semula jadi daripada RC boleh memberi kesan kepada fungsi, seperti jangka hayat yang dipendekkan bagi keadaan P+QB yang dipisahkan cas (31, 34, 35). Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa kewujudan cincin LH1 tempatan yang mengelilingi RC mungkin mengekalkan tapak QB yang "tertutup", sekali gus memelihara persekitaran tempatan berhampiran QB.
Walaupun apolipoprotein (tanpa QB quinone) dan struktur lengkap hanya mewakili dua gambaran ringkas tentang perolehan tapak QB, bukannya satu siri peristiwa, terdapat petunjuk bahawa pengikatan boleh dikawal untuk mencegah pengikatan semula oleh hidrokuinon. Untuk menghalang perencatan substrat. Interaksi quinolol dan quinone berhampiran tapak QB apolipoprotein mungkin berbeza, yang membawa kepada penolakannya oleh RC. Telah lama dicadangkan bahawa perubahan konformasi memainkan peranan dalam pengikatan dan pengurangan kuinon. Keupayaan RC beku untuk mengurangkan kuinon selepas penyesuaian gelap terjejas (36); Kristalografi sinar-X menunjukkan bahawa kerosakan ini disebabkan oleh kuinon QB yang terperangkap dalam konformasi "distal" kira-kira 4.5 Å dari kedudukan proksimal aktif (26), 37). Kami mencadangkan bahawa konformasi pengikatan distal ini adalah gambaran ringkas tentang keadaan pertengahan antara apolipoprotein dan struktur cincin penuh, yang mengikuti interaksi awal dengan kuinon dan pembukaan tapak QB.
RC jenis II yang terdapat dalam kompleks PSII bakteria fototrofik tertentu dan sianobakteria, alga dan tumbuhan mempunyai pemuliharaan struktur dan fungsi (38). Penjajaran struktur yang ditunjukkan dalam Rajah 6 (D dan E) menekankan persamaan antara RC PSII dan tapak QB kompleks RC bakteria. Perbandingan ini telah lama menjadi model untuk mengkaji sistem pengikatan dan pengurangan kuinon yang berkait rapat. Penerbitan terdahulu mencadangkan bahawa perubahan konformasi disertai dengan pengurangan kuinon PSII (39, 40). Oleh itu, memandangkan pemuliharaan evolusi RC, mekanisme pengikatan yang sebelum ini tidak diperhatikan ini juga mungkin boleh digunakan pada tapak QB RC PSII dalam tumbuhan fototrofik beroksigen.
Rps ΔpufW (pemadaman pufW tanpa label) dan strain PufW-His (protein bertanda His 10x C-terminal-W yang diekspresikan daripada lokus pufW semula jadi). palustris CGA009 telah diterangkan dalam kajian kami sebelum ini (16). Strain ini dan induk jenis liar isogenik telah diperoleh daripada peti sejuk beku dengan mencalarkan sebilangan kecil sel pada plat PYE (setiap 5 g liter -1) (disimpan dalam LB pada -80 °C, mengandungi 50% (b/v) gliserol) protein, ekstrak yis dan agar suksinat [1.5% (b/v)]. Plat tersebut diinkubasi semalaman dalam keadaan gelap pada suhu bilik di bawah keadaan anaerobik, dan kemudian diterangi dengan cahaya putih (~50 μmolm-2 s-1) yang disediakan oleh mentol halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) selama 3 hingga 5 hari sehingga satu koloni muncul. Satu koloni tunggal digunakan untuk menyuntik 10 ml medium M22+ (41) yang ditambah dengan 0.1% (w/v) asid kasamino (selepas ini dirujuk sebagai M22). Kultur tersebut ditumbuhkan di bawah keadaan oksigen rendah dalam keadaan gelap pada suhu 34°C dengan penggoncangan pada 180 rpm selama 48 jam, dan kemudian 70 ml kultur tersebut diinokulasi di bawah keadaan yang sama selama 24 jam. Kultur separa aerobik dengan isipadu 1 ml digunakan untuk menyuntik 30 ml medium M22 dalam botol kaca lutsinar universal 30 ml dan disinari dengan pengadukan (~50μmolm-2 s-1) selama 48 jam dengan daya magnet steril. Kemudian 30 ml kultur tersebut diinokulasi dengan kira-kira 1 liter kultur di bawah keadaan yang sama, yang kemudiannya digunakan untuk menyuntik kira-kira 9 liter kultur yang diterangi pada ~200 μmolm-2 s-1 selama 72 jam. Sel-sel telah dituai melalui sentrifugasi pada 7132 RCF selama 30 minit, digantung semula dalam ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), dan disimpan pada -20°C sehingga diperlukan.
Selepas pencairan, tambahkan beberapa hablur deoksiribonuklease I (Merck, UK), lisozim (Merck, UK) dan dua tablet perencat protease holoenzim Roche (Merck, UK) ke dalam sel yang telah digantung semula. Dalam sel tekanan Perancis 20,000 psi (Aminco, USA), sel-sel tersebut telah dipecahkan sebanyak 8 hingga 12 kali. Selepas membuang sel yang tidak pecah dan serpihan yang tidak larut melalui sentrifugasi pada 18,500 RCF selama 15 minit pada suhu 4°C, membran telah dimendakkan daripada lisat berpigmen melalui sentrifugasi pada 113,000 RCF selama 2 jam pada suhu 43,000°C. Buang pecahan larut dan gantungkan semula membran berwarna dalam 100 hingga 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) dan homogenkan sehingga tiada agregat yang kelihatan. Membran terampai diinkubasi dalam 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) yang mengandungi 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam dalam keadaan gelap pada suhu 4°C dengan pengacakan perlahan. Kemudian, emparkan pada suhu 70°C untuk melarutkan 150,000 RCF pada suhu 4°C selama 1 jam untuk membuang sisa bahan tidak larut.
Membran pelarut daripada strain ΔpufW telah digunakan pada lajur pertukaran ion DEAE Sepharose 50 ml dengan tiga isipadu lajur (CV) penimbal pengikat [20 mM tris-HCl (pH 8.0) yang mengandungi 0.03% (w/v) β-DDM]. Basuh lajur dengan dua penimbal pengikat CV, kemudian basuh lajur dengan dua penimbal pengikat yang mengandungi 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 telah dielusi dengan kecerunan linear 150 hingga 300 mM NaCl (dalam penimbal pengikat) pada 1.75 CV, dan kompleks pengikat yang tinggal telah dielusi dengan penimbal pengikat yang mengandungi 300 mM NaCl pada 0.5 CV. Kumpulkan spektrum penyerapan antara 250 dan 1000 nm, pastikan pecahan dengan nisbah penyerapan (A880/A280) lebih besar daripada 1 pada 880 hingga 280 nm, cairkannya dua kali dalam penimbal pengikat, dan gunakan prosedur yang sama sekali lagi pada lajur DEAE Pada penulenan. Cairkan pecahan dengan nisbah A880/A280 lebih tinggi daripada 1.7 dan nisbah A880/A805 lebih tinggi daripada 3.0, lakukan pusingan ketiga pertukaran ion, dan kekalkan pecahan dengan nisbah A880/A280 lebih tinggi daripada 2.2 dan nisbah A880/A805 lebih tinggi daripada 5.0. Kompleks yang telah ditulenkan separa telah dipekatkan kepada ~2 ml dalam penapis emparan Amicon 100,000 pemecut berat molekul (MWCO) (Merck, UK), dan dimuatkan pada lajur pengecualian saiz Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) yang mengandungi penimbal 200 mM NaCl, dan kemudian dielusi dalam penimbal yang sama pada 1.5 CV. Kumpulkan spektrum penyerapan bagi pecahan pengecualian saiz, dan pekatkan spektrum penyerapan dengan nisbah A880/A280 melebihi 2.4 dan nisbah A880/A805 melebihi 5.8 hingga 100 A880, dan segera gunakannya untuk penyediaan atau penyimpanan grid krio-TEM. Simpan pada -80°C sehingga diperlukan.
Membran pelarut daripada strain PufW-His telah digunakan pada 20 ml lajur HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) yang mengandungi 200 mM NaCl dan 0.03% (b/b)) dalam penimbal IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Lajur tersebut dibasuh dengan lima CV penimbal IMAC, dan kemudian dengan lima CV penimbal IMAC yang mengandungi 10 mM histidin. Kompleks teras telah dielusi daripada lajur dengan lima penimbal IMAC yang mengandungi 100 mM histidin. Pecahan yang mengandungi kompleks RC-LH114-W ditumpukan kepada ~10 ml dalam tangki yang dikacau yang dilengkapi dengan penapis Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), dicairkan sebanyak 20 kali dengan penimbal pengikat, dan kemudian ditambah kepada 25 ml. Dalam lajur DEAE Sepharose, empat CV yang terikat pada penimbal digunakan terlebih dahulu. Basuh lajur dengan empat penimbal pengikat CV, kemudian elusi kompleks pada lapan CV pada kecerunan linear 0 hingga 100 mM NaCl (dalam penimbal pengikat), dan baki empat CV yang mengandungi penimbal pengikat 100 mM. Kompleks baki yang dielusi pada natrium klorida yang digabungkan dengan nisbah A880/A280 lebih tinggi daripada 2.4 dan nisbah A880/A805 lebih tinggi daripada 4.6 pecahan ditumpukan kepada ~2 ml dalam penapis emparan Amicon 100,000 MWCO, dan diisi dengan IMAC 1.5 CV terlebih dahulu. Penimbal telah mengimbangi lajur pengecualian bersaiz Superdex 200 16/600, dan kemudian dielusi dalam penimbal yang sama pada 1.5 CV. Kumpulkan spektrum penyerapan bagi pecahan pengecualian saiz dan pekatkan spektrum penyerapan dengan nisbah A880/A280 melebihi 2.1 dan nisbah A880/A805 melebihi 4.6 hingga 100 A880, yang akan digunakan serta-merta untuk penyediaan grid TEM beku atau disimpan pada suhu -80°C sehingga diperlukan.
Sebuah peti sejuk rendam Leica EM GP telah digunakan untuk menyediakan grid TEM suhu rendah. Kompleks tersebut dicairkan dalam penimbal IMAC kepada A880 sebanyak 50, dan kemudian 5μl dimuatkan ke atas jaringan kuprum bersalut karbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 yang baru dinyahcas cahaya (Agar Scientific, UK). Inkubasi grid pada suhu 20°C dan kelembapan relatif 60% selama 30 saat, kemudian lap sehingga kering selama 3 saat, dan kemudian padamkannya dalam etana cecair pada -176°C.
Data kompleks RC-LH114-W telah direkodkan pada eBIC (Pusat Pengimejan Bio Elektronik) (Sumber Cahaya Berlian British) dengan mikroskop Titan Krios, yang berfungsi pada voltan pecutan 300kV, dengan pembesaran nominal 130,000× dan tenaga 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum dengan pengesan puncak K2 telah digunakan untuk merakam imej dalam mod pengiraan bagi mengumpul data. Saiz piksel yang dikalibrasi ialah 1.048Å, dan kadar dos ialah 3.83 e-Å-2s-1. Mengumpul filem dalam 11 saat dan membahagikannya kepada 40 bahagian. Gunakan kawasan bersalut karbon untuk memfokuskan semula mikroskop, kemudian kumpulkan tiga filem setiap lubang. Secara keseluruhan, 3130 filem telah dikumpulkan, dengan nilai defokus antara -1 dan -3μm.
Data untuk kompleks RC-LH116 dikumpulkan menggunakan mikroskop yang sama di Makmal Biostruktur Asterbury (Universiti Leeds, UK). Data dikumpulkan dalam mod pengiraan dengan pembesaran 130 k, dan saiz piksel dikalibrasi kepada 1.065 Å dengan dos 4.6 e-Å-2s-1. Filem ini dirakam dalam masa 12 saat dan dibahagikan kepada 48 bahagian. Secara keseluruhan, 3359 filem telah dikumpulkan, dengan nilai defokus antara -1 dan -3μm.
Semua pemprosesan data dilakukan dalam saluran paip Relion 3.0 (42). Gunakan Motioncorr 2 (43) untuk membetulkan gerakan pancaran melalui pemberat dos, dan kemudian gunakan CTFFIND 4.1 (44) untuk menentukan parameter CTF (fungsi pemindahan kontras). Fotomikrograf tipikal selepas peringkat pemprosesan awal ini ditunjukkan dalam Rajah 2. S16. Templat pemilihan automatik dijana dengan memilih secara manual kira-kira 250 piksel daripada 1000 zarah dalam bingkai 250 piksel dan tiada klasifikasi dua dimensi (2D) rujukan, sekali gus menolak klasifikasi yang memenuhi pencemaran sampel atau tidak mempunyai ciri yang boleh dibezakan. Kemudian, pemilihan automatik dilakukan pada semua mikrofotograf, dan RC-LH114-W ialah 849,359 zarah, dan kompleks RC-LH116 ialah 476,547 zarah. Semua zarah yang dipilih telah menjalani dua pusingan pengelasan 2D bukan rujukan, dan selepas setiap larian, zarah yang memenuhi luas karbon, pencemaran sampel, tiada ciri yang jelas atau zarah yang sangat bertindih ditolak, menghasilkan 772,033 (90.9%) dan 359,678 (75.5%) ) Zarah digunakan untuk pengelasan 3D RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing. Model rujukan 3D awal dijana menggunakan kaedah penurunan kecerunan stokastik. Menggunakan model awal sebagai rujukan, zarah yang dipilih dikelaskan kepada empat kategori dalam 3D. Menggunakan model dalam kategori ini sebagai rujukan, lakukan penapisan 3D pada zarah dalam kategori terbesar, kemudian gunakan penapis laluan rendah 15Å awal untuk menutup kawasan pelarut, tambah 6 piksel tepi lembut, dan proses pasca piksel untuk membetulkan fungsi pemindahan Modulasi puncak Gatan K2 bagi pengesan atas. Bagi set data RC-LH114-W, model awal ini telah diubah suai dengan membuang ketumpatan kuat di tepi topeng (terputus daripada ketumpatan kompleks teras dalam UCSF Chimera). Model yang terhasil (resolusi RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing ialah 3.91 dan 4.16 Å) digunakan sebagai rujukan untuk pusingan kedua pengelasan 3D. Zarah-zarah yang digunakan dikumpulkan ke dalam kelas 3D awal dan tidak mengandungi korelasi yang kuat dengan kejiranan. Pertindihan atau kekurangan ciri struktur yang jelas. Selepas pusingan kedua pengelasan 3D, kategori dengan resolusi tertinggi telah dipilih [Bagi RC-LH114-W, satu kategori ialah 377,703 zarah (44.5%), bagi RC-LH116, terdapat dua kategori, berjumlah 260,752 zarah (54.7%), di mana ia adalah sama hanya apabila diselaraskan selepas putaran awal dengan perbezaan kecil]. Zarah-zarah yang dipilih diekstrak semula dalam kotak 400 piksel dan ditapis melalui penapisan 3D. Topeng pelarut dijana menggunakan penapis laluan rendah 15Å awal, pengembangan peta 3 piksel dan topeng lembut 3 piksel. Menggunakan penambahbaikan CTF setiap zarah, pembetulan gerakan setiap zarah dan pusingan kedua penambahbaikan CTF setiap zarah, penambahbaikan 3D, penambahbaikan pelarut dan pemprosesan pasca dilakukan selepas setiap langkah untuk memperhalusi lagi tekstur yang terhasil. Menggunakan nilai pemotongan FSC (Pekali Korelasi Fourier Shell) sebanyak 0.143, resolusi model akhir RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing ialah 2.65 dan 2.80Å. Lengkung FSC model akhir ditunjukkan dalam Rajah 2. S17.
Semua jujukan protein dimuat turun daripada UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) telah digunakan untuk membina model homologi RC, yang mengandungi jujukan protein RC-L, RC-M dan RC-H serta struktur kristal Rba. sphaeroides RC telah digunakan sebagai templat (PDB ID: 5LSE) (46). Gunakan alat “peta padanan” dalam UCSF Chimera untuk memadankan model yang dijana pada peta (47), perbaiki struktur protein, dan kofaktor [4×BChl a (nama residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), satu atau dua jenis UQ10 (U10), satu besi bukan heme (Fe) dan satu 3,4-dihidroheksakarbonilkolina (QAK)] gunakan Coot (48) untuk menambah. Oleh kerana QAK tidak tersedia dalam perpustakaan monomer, ia telah diparameterkan menggunakan alat eLBOW dalam PHENIX (49).
Seterusnya, subunit LH1 dibina. Pada mulanya, alat pembinaan automatik dalam PHENIX (49) digunakan untuk membina sebahagian daripada jujukan LH1 secara automatik menggunakan peta dan jujukan protein LH1-α dan LH1-β sebagai input. Pilih subunit LH1 yang paling lengkap, ekstrak dan muatkannya ke dalam Coot, tambahkan jujukan yang hilang secara manual di dalamnya, dan perhalusi keseluruhan struktur secara manual sebelum menambah dua BCl (BCL) dan spirilloxanthin (CRT) [mengikut Rps yang berkaitan Ketumpatan kompleks LH1 dan kandungan karotenoid yang diketahui. Spesies (17)]. Salin subunit LH1 yang lengkap, dan gunakan "Alat Peta Docking" UCSF Chimera untuk mendock di kawasan bukan model bersebelahan dengan ketumpatan LH1, dan kemudian perhalusinya dalam Coot; ulangi proses sehingga semua subunit LH1 telah dimodelkan. Untuk struktur RC-LH114-W, dengan mengekstrak ketumpatan yang tidak diperuntukkan dalam Coot, protein dibahagikan daripada komponen bukan protein yang tinggal dalam peta Chimera USCF dan alat Autobuild digunakan untuk menetapkan model awal, dan Pemodelan subunit yang tinggal (protein-W). Dalam PHENIX (49). Tambahkan sebarang jujukan yang hilang pada model yang terhasil dalam Coot (48), dan kemudian perhalusi keseluruhan subunit secara manual. Ketumpatan yang tidak diperuntukkan yang tinggal sesuai dengan gabungan lipid (ID perpustakaan monomer PDB CDL = CDL, POPC = 6PL dan POPG = PGT), detergen β-DDM (LMT) dan molekul UQ10 (U10). Gunakan pengoptimuman PHENIX (49) dan pengoptimuman manual dalam Coot (48) untuk menyempurnakan model awal yang lengkap sehingga statistik model dan kualiti visual padanan tidak dapat diperbaiki lagi. Akhir sekali, gunakan LocScale (50) untuk mempertajam peta setempat, dan kemudian lakukan beberapa kitaran lain untuk memodelkan ketumpatan yang tidak diperuntukkan dan pengoptimuman automatik dan manual.
Peptida, kofaktor dan lipid serta kuinon lain yang berlabuh dalam ketumpatan masing-masing ditunjukkan dalam Rajah 1 dan 2. S18 hingga S23. Maklumat statistik model akhir ditunjukkan dalam Jadual S1.
Melainkan dinyatakan sebaliknya, spektrum penyerapan UV/Vis/NIR dikumpulkan pada spektrofotometer Cary60 (Agilent, USA) pada selang 1 nm dari 250 nm hingga 1000 nm dan masa penyepaduan 0.1s.
Cairkan sampel dalam kuvet kuarza dengan laluan 2 mm kepada A880 sebanyak 1, dan kumpulkan spektrum penyerapan antara 400 dan 1000 nm. Spektrum dikroik bulat dikumpulkan pada spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepun) pada selang 1 nm antara 400 nm dan 950 nm pada kadar imbasan 20 nm min-1.
Pekali kepupusan molar ditentukan dengan mencairkan kompleks teras kepada A880 kira-kira 50. Cairkan isipadu 10μl dalam penimbal pengikat 990μl atau metanol, dan kumpulkan spektrum penyerapan dengan segera untuk meminimumkan degradasi BChl. Kandungan BChl setiap sampel metanol dikira dengan pekali kepupusan pada 771 nm bagi 54.8 mM-1 cm-1, dan pekali kepupusan ditentukan (51). Bahagikan kepekatan BChl yang diukur dengan 32 (RC-LH114-W) atau 36 (RC-LH116) untuk menentukan kepekatan kompleks teras, yang kemudiannya digunakan untuk menentukan spektrum penyerapan sampel yang sama yang dikumpulkan dalam pekali kepupusan penimbal. Tiga ukuran berulang telah diambil untuk setiap sampel, dan purata penyerapan maksimum BChl Qy digunakan untuk pengiraan. Pekali kepupusan RC-LH114-W yang diukur pada 878 nm ialah 3280±140 mM-1 cm-1, manakala pekali kepupusan RC-LH116 yang diukur pada 880 nm ialah 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 diukur mengikut kaedah dalam (52). Pendek kata, HPLC fasa terbalik (RP-HPLC) telah dilakukan menggunakan sistem HPLC Agilent 1200. Larutkan kira-kira 0.02 nmol RC-LH116 atau RC-LH114-W dalam 50μl metanol:kloroform 50:50 yang mengandungi 0.02% (w/v) ferik klorida, dan suntikan Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm yang telah diseimbangkan terlebih dahulu. Larutkan dalam 1 ml-1 min-1 pada suhu 40°C dalam pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) pada lajur ×25 cm. Lakukan elusi isokratik dalam pelarut HPLC untuk memantau penyerapan pada 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) dan 780 nm (BChl) selama 1 jam. Puncak dalam kromatogram 275 nm pada 25.5 minit telah disepadukan, yang tidak mengandungi sebarang sebatian lain yang boleh dikesan. Kawasan bersepadu digunakan untuk mengira jumlah molar UQ10 yang diekstrak dengan merujuk kepada lengkung penentukuran yang dikira daripada suntikan piawai tulen dari 0 hingga 5.8 nmol (Rajah S14). Setiap sampel dianalisis dalam tiga replika, dan ralat yang dilaporkan sepadan dengan SD purata.
Satu larutan yang mengandungi kompleks RC-LH1 dengan penyerapan Qy maksimum 0.1 telah disediakan dengan 30 μM sitokrom c2 jantung kuda terkurang (Merck, UK) dan 0 hingga 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tiga sampel 1-ml telah disediakan pada setiap kepekatan UQ2 dan diinkubasi semalaman dalam gelap pada suhu 4°C untuk memastikan penyesuaian lengkap kepada gelap sebelum pengukuran. Larutan tersebut telah dimuatkan ke dalam spektrofotometer modular OLIS RSM1000 yang dilengkapi dengan kisi nyalaan/garis 500 300 nm, salur masuk 1.24 mm, celah tengah 0.12 mm dan celah keluar 0.6 mm. Penapis lulus panjang 600 nm diletakkan di pintu masuk tiub foto sampel dan tiub pengganda foto rujukan untuk mengecualikan cahaya pengujaan. Penyerapan dipantau pada 550 nm dengan masa integrasi 0.15 s. Cahaya pengujaan dipancarkan daripada LED (Diod Pemancar Cahaya) M880 nm M880F2 (Thorlabs Ltd., UK) melalui kabel gentian optik pada keamatan 90% melalui pengawal DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) dan dipancarkan kepada sumber cahaya pada sudut 90°. Pancaran pengukur bertentangan dengan cermin untuk mengembalikan sebarang cahaya yang pada mulanya tidak diserap oleh sampel. Pantau penyerapan 10 s sebelum pencahayaan 50 s. Kemudian penyerapan dipantau selanjutnya selama 60 s dalam gelap untuk menilai sejauh mana kuinolol secara spontan mengurangkan sitokrom c23+ (lihat Rajah S8 untuk data mentah).
Data diproses dengan memadankan kadar permulaan linear dalam lingkungan 0.5 hingga 10 s (bergantung pada kepekatan UQ2) dan membuat purata kadar ketiga-tiga sampel pada setiap kepekatan UQ2. Kepekatan RC-LH1 yang dikira oleh pekali kepupusan masing-masing telah digunakan untuk menukar kadar tersebut kepada kecekapan pemangkin, yang diplotkan dalam Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), dan dipadankan dengan model Michaelis-Menten untuk menentukan nilai Km dan Kcat ketara.
Untuk pengukuran penyerapan sementara, sampel RC-LH1 dicairkan kepada ~2μM dalam penimbal IMAC yang mengandungi 50 mM natrium askorbat (Merck, USA) dan 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Asid askorbik digunakan sebagai penderma elektron korban, dan tert-butaclofen digunakan sebagai perencat QB untuk memastikan penderma RC utama kekal berkurangan (iaitu, tidak teroksidasi secara foto) sepanjang proses pengukuran. Kira-kira 3 ml sampel ditambah ke dalam sel berputar tersuai (diameter kira-kira 0.1 m, 350 RPM) dengan panjang laluan optik 2 mm untuk memastikan sampel dalam laluan laser mempunyai masa yang cukup untuk penyesuaian gelap antara denyutan pengujaan. Gunakan denyutan laser ~100-fs untuk menguatkan sistem laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) untuk mengujakan sampel pada 880 nm pada kadar pengulangan 1 kHz (20 nJ untuk NIR atau 100 nJ untuk Vis). Sebelum mengumpul data, dedahkan sampel kepada cahaya pengujaan selama kira-kira 30 minit. Pendedahan akan menyebabkan penyahaktifan QA (mungkin mengurangkan QA sekali atau dua kali). Tetapi sila ambil perhatian bahawa proses ini boleh diterbalikkan kerana selepas tempoh penyesuaian gelap yang panjang, RC akan kembali kepada aktiviti QA secara perlahan-lahan. Spektrometer Helios (Ultrafast Systems, USA) telah digunakan untuk mengukur spektrum sementara dengan masa tunda -10 hingga 7000 ps. Gunakan perisian Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) untuk memisahkan set data, kemudian gabungkan dan piawaikan. Gunakan pakej perisian CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) untuk menggunakan set data gabungan bagi mendapatkan spektrum pembezaan yang berkaitan dengan pereputan, atau gunakan fungsi yang menggabungkan berbilang eksponen dengan tindak balas instrumen agar sesuai dengan evolusi spektrum panjang gelombang tunggal dalam Origin (OriginLab, USA).
Seperti yang dinyatakan di atas (53), filem fotosintesis yang mengandungi kompleks LH1 yang kekurangan antena RC dan periferal LH2 telah disediakan. Membran telah dicairkan dalam 20 mM tris (pH 8.0) dan kemudian dimuatkan ke dalam kuvet kuarza dengan laluan optik 2 mm. Denyut laser 30nJ telah digunakan untuk mengujakan sampel pada 540 nm dengan masa tunda -10 hingga 7000 ps. Proses set data seperti yang diterangkan untuk sampel Rps. pal.
Membran tersebut di-pellet melalui sentrifugasi pada 150,000 RCF selama 2 jam pada suhu 4°C, dan kemudian penyerapannya pada 880 nm digantung semula dalam 20 mM tris-HCl (pH 8.0) dan 200 mM NaCl. Larutkan membran dengan mengacau perlahan-lahan dalam 2% (b/v) β-DDM selama 1 jam dalam keadaan gelap pada suhu 4°C. Sampel dicairkan dalam 100 mM trietilamonium karbonat (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) kepada kepekatan protein 2.5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pemprosesan selanjutnya dijalankan daripada kaedah yang diterbitkan sebelum ini (54), bermula dengan pencairan 50 μg protein ke dalam sejumlah 50 μl TEAB yang mengandungi 1% (b/v) natrium laurat (Merck, UK). Selepas sonikasi selama 60 saat, ia dikurangkan dengan 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, UK) pada suhu 37°C selama 30 minit. Untuk pengalkilan-S, inkubasi sampel dengan 10 mM metil S-metiltiometanasulfonat (Merck, UK) dan tambahkannya daripada larutan stok isopropanol 200 mM selama 10 minit pada suhu bilik. Pencernaan proteolitik dijalankan dengan menambah 2 μg campuran tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 jam. Surfaktan laurat diekstrak dengan menambah 50 μl etil asetat dan 10 μl asid trifluoroasetik gred LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) dan vorteks selama 60 saat. Pemisahan fasa digalakkan melalui sentrifugasi pada 15,700 RCF selama 5 minit. Menurut protokol pengilang, lajur spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) telah digunakan untuk menyedut dan menyahgaram fasa bawah yang mengandungi peptida dengan teliti. Selepas pengeringan melalui sentrifugasi vakum, sampel dilarutkan dalam 0.5% TFA dan 3% asetonitril, dan 500 ng dianalisis melalui kromatografi RP nanoflow yang digandingkan dengan spektrometri jisim menggunakan parameter sistem yang diperincikan sebelum ini.
Gunakan MaxQuant v.1.5.3.30 (56) untuk pengenalpastian dan kuantifikasi protein bagi mencari pangkalan data proteom Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data proteomik spektrometri jisim telah disimpan dalam ProteomeXchange Alliance melalui repositori rakan kongsi PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) di bawah pengecam set data PXD020402.
Untuk analisis melalui RPLC yang digandingkan dengan spektrometri jisim pengionan elektrosemburan, kompleks RC-LH1 disediakan daripada Rps jenis liar. Menggunakan kaedah yang diterbitkan sebelum ini (16), kepekatan protein yang dihasilkan dalam sel palustris ialah 2 mg ml-1 dalam 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl dan 0.03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad)) DDM. Mengikut protokol pengilang, gunakan kit penulenan 2D (GE Healthcare, USA) untuk mengekstrak 10 μg protein melalui kaedah pemendakan, dan larutkan mendakan dalam 20 μl 60% (v/v) asid formik (FA), 20% (v/v) Asetonitril dan 20% (v/v) air. Lima mikroliter dianalisis melalui RPLC (Dionex RSLC) yang digandingkan dengan spektrometri jisim (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gunakan lajur MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) untuk pemisahan pada 60°C dan 100μlmin -1, dengan kecerunan 85% (v/v) pelarut A [0.1% (v/v) FA dan 0.02% (V/v) larutan akueus TFA] kepada 85%(v/v) pelarut B [0.1%(v/v) FA dan 0.02%(v/v) dalam 90%(v/v) asetonitril TFA] Menggunakan sumber pengionan elektrosemburan piawai dan parameter lalai selama lebih daripada 60 minit, spektrometer jisim memperoleh 100 hingga 2750 m/z (nisbah jisim-kepada-cas). Dengan bantuan portal sumber bioinformatik ExPASy alat FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), petakan spektrum jisim kepada subunit kompleks.
Sel-sel telah ditumbuhkan selama 72 jam di bawah 100 ml NF-rendah (10μMm-2 s-1), sederhana (30μMm-2 s-1) atau tinggi (300μMm-2 s-1) cahaya. Medium M22 (medium M22 di mana ammonium sulfat diabaikan dan natrium suksinat digantikan dengan natrium asetat) dalam botol skru atas 100 ml (23). Dalam lima kitaran 30-an, manik kaca 0.1 mikron telah dimanikkan pada nisbah isipadu 1:1 untuk melisiskan sel dan disejukkan di atas ais selama 5 minit. Bahan yang tidak larut, sel yang tidak pecah dan manik kaca telah dibuang melalui sentrifugasi pada 16,000 RCF selama 10 minit dalam mikrosentrifug atas meja. Membran telah diasingkan dalam rotor Ti 70.1 dengan 100,000 RCF dalam 20 mM tris-HCl (pH 8.0) dengan kecerunan sukrosa 40/15% (b/b) selama 10 jam.
Seperti yang diterangkan dalam kajian kami sebelum ini, pengesanan imun tag His pada PufW (16). Pendek kata, kompleks teras yang telah ditulenkan (11.8 nM) atau membran yang mengandungi kepekatan RC yang sama (ditentukan dengan pengoksidaan menolak spektrum perbezaan yang dikurangkan dan memadankan beban pada gel yang diwarnakan) dalam penimbal pemuatan 2x SDS (Merck, UK) dicairkan dua kali. Protein telah diasingkan pada replika gel NuPage 12% bis-tris (Thermo Fisher Scientific, UK). Gel telah diwarnakan dengan Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) untuk memuatkan dan menggambarkan subunit RC-L. Protein pada gel kedua telah dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF) yang diaktifkan metanol (Thermo Fisher Scientific, UK) untuk ujian imuno. Membran PVDF telah disekat dalam 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 dan 5% (w/v) susu serbuk skim, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi primer anti-His (dalam Cairkan penimbal antibodi [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl dan 0.05% (v/v) Tween-20] dalam 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) selama 4 jam. Selepas dibasuh 3 kali selama 5 minit dalam penimbal antibodi, membran digabungkan dengan antibodi sekunder anti-tikus peroksidase lobak (Sigma-Aldrich, UK) (dicairkan 1:10,000 dalam penimbal antibodi). Inkubasi untuk membolehkan pengesanan (5 minit selepas 3 kali dibasuh dalam penimbal antibodi) menggunakan substrat kemiluminesen WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Itali) dan Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Dengan melukis taburan keamatan setiap gel berwarna atau lorong ujian imuno, mengintegrasikan kawasan di bawah puncak dan mengira nisbah keamatan RC-L (gel berwarna) dan Protein-W (ujian imuno), dalam ImageJ (57) Proses imej. Nisbah ini ditukar kepada nisbah molar dengan mengandaikan bahawa nisbah RC-L kepada protein-W dalam sampel RC-LH114-W tulen ialah 1:1 dan menormalkan keseluruhan set data dengan sewajarnya.
Untuk bahan tambahan bagi artikel ini, sila lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ini merupakan artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah terma Lesen Atribusi Creative Commons. Artikel ini membenarkan penggunaan, pengedaran dan penghasilan semula tanpa had dalam sebarang medium dengan syarat karya asal dipetik dengan betul.
Nota: Kami hanya meminta anda memberikan alamat e-mel anda supaya orang yang anda cadangkan ke halaman tersebut tahu bahawa anda mahu mereka melihat e-mel tersebut dan ia bukan spam. Kami tidak akan merekodkan sebarang alamat e-mel.
Soalan ini digunakan untuk menguji sama ada anda seorang pelawat dan mencegah penyerahan spam automatik.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahaya 1 di pusat tindak balas memberikan pandangan baharu ke dalam dinamik kuinon.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahaya 1 di pusat tindak balas memberikan pandangan baharu ke dalam dinamik kuinon.
©2021 American Association for the Advancement of Science. semua hak terpelihara. AAAS ialah rakan kongsi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.